Utilisation du vecteur appât pPC97-XBTBD6- ∆ BTB

Nous avons décidé d’effectuer une nouvelle recherche de la cible spécifique de XBTBD6. Pour cela nous avons décidé de réaliser un criblage à l’aide d’un appât constitué par la protéine XBTBD6 délétée de son domaine BTB-POZ. En effet, nous pensions qu’avec cet appât nous éviterions la sélection des clones contenant les proies constituées par XBTBD6 et XBTBD3 et que de plus nous favoriserions la sélection des clones avec la proie contenant la cible physiologique de XBTBD6. Nous avons construit le vecteur pPC97 contenant la séquence codant de XBTBD6 délétée de la séquence codant pour le domaine

BTB-POZ (pPC97-XBTBD6-∆BTB). Comme nous l’avons fait pour l’appât

pPC97-XBTBD6, nous avons vérifié la présence du vecteur dans les clones de levures sélectionnés en effectuant une préparation d’ADN plasmidique sur laquelle nous avons effectué une PCR à l’aide d’amorces spécifiques. La construction appât que nous utilisons ne doit pas elle-même activer les gènes rapporteurs. Nous avons donc contrôlé que les levures transformées ne poussent pas sur les milieux carencés en histidine et adénine sulfate et ne donnent pas de coloration bleue aux tests X-gal en milieu liquides (Figure 32). L’ensemble de ces contrôles s’est avéré positif pour le vecteur appât pPC97-XBTBD6-∆BTB. Construction qui est donc

RESULTATS

51 adaptée pour rechercher la ou les cibles potentielles de XBTBD6 par criblage par double hybride en levures.

La transformation à grande échelle pour le criblage par double hybride a permis d’obtenir environ 3 millions de doubles transformants contenant le vecteur appât

pPC97-XBTBD6-∆BTB et le vecteur proie pPC86-ADNc d’embryons de xénope au stade

neurula. Après étalement sur milieu carencé en adénine sulfate et histidine les 30 clones ayant pu croître le plus rapidement et ayant un diamètre d’au moins 1 millimètre ont été sélectionnés et repiqués sur milieu carencé en adénine sulfate et histidine fraîchement préparé. 18 clones ont poussé et ont été soumis au test X-gal sur milieu solide. Tous les clones ont développé une coloration bleue et ont été amplifiés pour permettre la purification des ADNc plasmidiques. Les inserts contenus dans les vecteurs proies ont été amplifiés par PCR à l’aide d’amorces spécifiques complémentaires de séquences contenues dans le vecteur proie et encadrant le site de clonage puis purifiés et séquencés à l’aide d’une amorce permettant de déterminer la séquence de la jonction entre le domaine d’activation transcriptionnelle de Gal4 et l’insert contenu dans le vecteur proie. Les séquences ont ensuite été analysées par comparaison aux bases de données informatiques à l’aide du programme BLAST.

Nous avons identifié 8 protéines différentes comme partenaires protéiques potentiels de XBTBD6 :

La séquence partielle n°1 code pour 56% de la protéine Ell2 (Ell-Related RNA Polymerase II, Elongation Factor). Nous n’avons pas déterminé avec précision l’ATG initiateur de la traduction. C’est une enzyme de type RNA polymérase impliquée dans la transcription (Shilatifard et al., 1997) et qui joue un rôle dans le cycle cellulaire (Johnstone et al., 2001).

Les séquences n°2, n°7 et n°14 codent pour respectivement 76%, 55% et 74% de la protéine MYL2 (Myosin regulatory light chain 2) de xénope. C’est une protéine de type myosine initialement mise en évidence dans le cœur où elle est largement représentée (Dalla et al., 1989). MYLC2 interagit avec la protéine MYβHC (Cardiac Myosin β Heavy Chain) pour former un hexamère constitué de 2 chaînes lourdes MYHC et de 4 chaînes légères MYLC2 (Wadgaonkar et al., 1993). Les chaînes légères de myosine possèdent un site de phosphorylation à l’extrémité N terminale, ce qui permet de réguler les propriétés contractiles de la macromolécule. Il nous semble intéressant de noter que les travaux de Kim, Y. et al. montrent que la phosphorylation des chaînes légères des myosines induit une inhibition de la croissance des neurites et une absence du cône de croissance dans une culture de neurones

RESULTATS

52 provenant de l’hippocampe de rat (Kim and Chang, 2004). Il a été montré par ailleurs que la chaîne légère de myosine MRLC3 interagit avec l’enzyme ubiquitine ligase E3 MIR (MRLC Interacting Protein) et cette association guide la myosine vers l’ubiquitination et la dégradation par le protéasome 26S. La protéolyse de MRLC induit l’inhibition de la croissance des neurites dans les Neuro2A et dans les PC12 (Bornhauser et al., 2003).

La séquence n°3 code pour 36% de la protéine DECR1 (2,4-dienoyl CoA reductase 1, mitochondrial) de xénope. Nous n’avons pas déterminé avec précision l’ATG initiateur de la traduction. C’est une enzyme mitochondriale qui participe au métabolisme des acides gras insaturés (Helander et al., 1997).

La séquence n°5 code pour 66% de la protéine SAP155 (Splicing factor 3b) de xénope. Nous n’avons pas déterminé avec précision l’ATG initiateur de la traduction. C’est une protéine impliquée dans un complexe de splicing des ARNm au sein des spliceosomes (Golas et al., 2003).

Les séquences n°6 et n°8 codent pour respectivement 76% et 77% de la protéine CCT8 (Chaperonin containing T complex polypeptide 8) de xénope. Cette protéine est un constituant du complexe TCP1 qui agit comme une macromolécule chaperone impliquée dans la maturation et l’organisation des protéines du cytosquelette (Ursic et al., 1994). Notons de plus que Roobol, A. et al. a montré que le complexe TCP1 participe au développement des neurites dans les cellules ND7/23 (Roobol et al., 1995).

La séquence n°9 code pour 33% du facteur d’initiation de la traduction eIF1 (eukaryotic translation Initiation Factor 1) de xénope. Nous n’avons pas déterminé avec précision l’ATG initiateur de la traduction. Ce facteur joue un rôle principal dans la sélection du codon d’initiation (Pestova and Kolupaeva, 2002).

Les séquences n°11, n°4 et n°12 codent pour respectivement 36%, 76% et 77% de la protéine MYO1C (Myosin 1C) de xénope. Cette myosine dites « non conventionelle » possèdent, en association avec la protéine d’actine, les propriétés contractiles caractéristiques de cette famille de protéine. Cependant la majorité des autres membres des myosines participent aux mécanismes musculaires qui permettent les contractions musculaires, la MYO1C se caractérise par la propriété « non conventionnelle » de participer aux mouvements intracellulaires. De façon intéressante, il a été montré que MYO1C participe à la régulation dynamique des lamellipodes présents à l’extrémité du cône de croissance neuronal (Wang et al., 2003 ; Diefenbach et al., 2002).

+ + + + - -- + -- - + IP : FLAG WB : MYC - 100 kDa FLAG-XBTBD6 MYC-XBTBD6 MYC-XCullin-3 MYC-XPIAS1 Non i n jecté

← Chaînes légères des Ac

← Chaînes lourdes des Ac

WB : MYC

WB : FLAG - 75 kDa - 100 kDa

Figure 40 : Analyse par immunoprécipitation de l’interaction entre XBTBD6 et XPIAS1.Pour surexprimer les différentes protéines de fusion nous avons injecté dans les embryons au stade deux cellules 500pg d’ARNm synthétique codant pour chacune d’entre elles. Au stade de développement 9 (blastula), les calottes animales sont excisées et mises en culture pendant 6 heures puis congelées dans de la glace carbonique. Pour l’expérience, les calottes sont lysées et les associations protéiques sont analysées par immunoprécipitation et western blot. Les gels du bas de la figure (notés WB : MYC et WB : FLAG) correspondent au western blot utilisant les anticorps primaires dirigés) p p p g respectivement contre l’épitope MYC et FLAG mettant en évidence l’expression des constructions dans le lysat des calottes animales. Le gel du haut de la figure (notés IP : FLAG WB : MYC) correspond au western blot utilisant les anticorps primaires dirigés contre l’épitope MYC mettant en évidence les protéines précipitées à l’aide de l’anticorps FLAG. Dans les conditions utilisées la protéine XBTBD6 homodimérise et interagit avec XCullin-3 mais notre expérience ne permet pas de mettre en évidence d’interaction entre les protéines XBTBD6 et XPIAS1.

RESULTATS

53 La séquence n°15 code pour 58% de la protéine KTR4 (Keratin 4). Cette protéine est une kératine de type II qui s’associe essentiellement avec la KTR13. L’hétérodimère constitué est un élément de la couche basale de l’épithélium de l’œsophage (Fuchs, 1988).

Les différentes protéines obtenues dans les deux criblages peuvent être des partenaires d’interactions potentiels avec XBTBD6, néanmoins nous avons choisi d’étudier dans un premier temps plus en détail l’interaction possible entre XBTBD6 et PIAS1 (XPIAS1). Il est tentant de penser que XBTBD6 puisse recruter, dans des conditions à déterminer, XPIAS1 comme sumo ligase E3 à la place de l’ubiquitine ligase E3 XCullin-3 et ainsi permettre la sumoylation de la protéine substrat. Cette protéine substrat pourrait être la topoisomérase I. Plusieurs travaux nous ont permis d’établir ce modèle hypothétique. Il a été montré d’une part que HBTBD1 et HBTBD2 interagissent avec la topoisomérase I (Xu et al., 2002) et d’autre part que cette enzyme peut être ubiquitinée (Desai et al., 1997) ou sumoylée (Mao et al., 2000b). Il a été suggéré que ces deux voies pouvaient être un mode de contrôle de l’activité de la topoisomérase I (Zhang et al., 2004). La similarité importante entre les protéines HBTBD1/2 et HBTBD3/6 peut nous faire supposer que la topoisomérase I interagit avec HBTBD3/6 et ainsi puisse être soit ubiquitinée soit sumoylée par ces enzymes. Nous avons donc cherché la confirmation biochimique de l’interaction de XBTBD6 et de XPIAS1.

Pour confirmer l’interaction biochimique entre XBTBD6 et XPIAS1 nous avons utilisé la méthode d’immunoprécipitation de protéines fusionnées aux séquences MYC et FLAG et surexprimées en embryons de xénope. Nous avons généré le vecteur PCS2-MYC-XPIAS1 et utilisé les vecteurs MYC-XCullin-3, FLAG-XBTBD6 et MYC-XBTBD6 et produit les ARNm synthétiques codant pour les protéines XBTBD6-FLAG, XBTBD6-MYC, XCullin3-MYC, XPIAS1-MYC. Les ARNm ont été injectés dans deux cellules d’embryons au stade 4 cellules. L’immunoprécipitation a été réalisée avec l’anticorps de souris anti-MYC. Le western blot a été révélé à l’aide d’anticorps primaires de souris anti-Flag et anti-HA et l’anticorps secondaire anti-souris lié à la peroxydase. Comme contrôle expérimental nous avons utilisé les propriétés d’interaction de la protéine XBTBD6 avec elle-même et avec XCullin-3. Malheureusement, bien que dans les conditions utilisées nous visualisons l’homodimérisation de XBTBD6 et son interaction avec XCullin-3, il nous a été impossible de mettre en évidence l’interaction entre XBTBD6 et XPIAS1 (Figure 40), Nous pouvons supposer que XPIAS1 est un faux positif. Pour confirmer le fait que XPIAS1 est un faux positif, il serait intéressant de recommencer le criblage avec pPC97-XBTBD6 de manière à vérifier si cette protéine ne réapparait pas de nouveau. De plus il serait intéressant

+ + + - - - - - - -MYC-XBTBD6 + + + - - - - - - -- - - + + + - - - -- - - - - - + + + -- - - - - - - - - + + + + - - + - - + - - + -- + - - + - - + - + -- - + - - + - - + - - + MYC-XMYL2 MYC-XCCT8 MYC-XMYO1C HA-XBTBD6 HA-XBTBD6-(N term) HA-XBTBD6-(C term) IP : HA WB : MYC WB : MYC WB : HA - 75 kDa - 75 kDa - 75 kDa - 25 kDa - 25 kDa - 75 kDa - 100 kDa - 100 kDa - 75 kDa - 75 kDa - 75 kDa - 75 kDa

Figure 41 : Analyse par immunoprécipitation des interactions entre XBTBD6 et les protéines XMYL2, XCCT8 et XMOY1C.Pour surexprimer les différentes protéines nous

t f té d f t it i d ll l COS7 l diffé t

- 37 kDa - 37 kDa - 37 kDa - 37 kDa

avons transfecté de façon transitoire des cellules COS7 avec les différentes constructions. Après 24 heures de culture les cellules sont lysées et les associations protéiques sont analysées par immunoprécipitation et western blot. Les gels du bas de la figure (notés WB : MYC et WB : HA) correspondent au western blot utilisant les anticorps primaires dirigés respectivement contre l’épitope MYC et HA mettant en évidence l’expression des constructions dans le lysat cellulaire avant la précipitation. Le gel du haut de la figure (notés IP : HA WB : MYC) correspond au western blot utilisant les anticorps primaires dirigés contre l’épitope MYC mettant en évidence les protéines précipitées à l’aide de l’anticorps HA Dans les conditions utilisées les résultats montrent que comme l aide de l anticorps HA. Dans les conditions utilisées, les résultats montrent que comme nous l’avons déjà montré, la protéine XBTBD6 homodimérise et interagit avec sa partie N-terminale contenant le domaine BTB-POZ. Par contre aucune des protéines testées, XMYL2, XCCT8 et XMOY1C, n’interagit avec XBTBD6 ou l’un de ses mutants.

RESULTATS

54 de vérifier la réalité ou non de l’interaction par une autre technique comme par exemple le GST pull down ou par la technique de la purification d’affinité en tandem (Tandem Affinity Purification ou TAP-TAG).

Nous pouvons remarquer que nous n’avons pas obtenu de candidats identiques dans les deux criblages. Les candidats obtenus lors du deuxième criblage peuvent être des partenaires potentiels mais il est apparu que 3 candidats semblaient particulièrement intéressants à la lumière des informations que nous avons trouvées dans la littérature. Ces trois protéines sont MYL2C, CCT8 et MYO1C, elles ont toutes une fonction importante dans la croissance des neurites ou du cône de croissance neuronal. Nous avons choisi d’étudier les interactions possibles entre XBTBD6 et ces différentes protéines. Nous avons décidé de confirmer l’interaction biochimique de ces nouveaux candidats en utilisant la méthode d’immunoprécipitation de protéine fusionnées aux séquences MYC et HA et surexprimées en cellules COS7. Nous avons utilisé les vecteurs déjà cités MYC-XBTBD6, HA-XBTBD6, HA-XBTBD6-Nterm et HA-XBTBD6-Cterm et nous avons généré les vecteurs XMYL2 (XMYL2), XCCT8 (MYC-XCCT8), pCDNA3-MYC-XMYO1C (MYC-pCDNA3-MYC-XMYO1C). A l’aide de l’ensemble de ces constructions il nous a été possible de tester les interactions supposées en transfection transitoire en cellules COS7 suivie par une expérience d’immunoprécipitation avec des billes de Sépharose G-50 couplées avec un anticorps spécifique dirigé contre l’épitope HA. Les résultats montrent que MYC-XBTBD6 interagit avec HA-MYC-XBTBD6 et HA-MYC-XBTBD6 Nterm. Malheureusement, il nous a été impossible de confirmer l’interaction supposée entre XBTBD6 et l’un des candidats,

XMYL2, XCCT8 ou XMO1C (Figure 41). Nous devons en conclure que soit nos conditions

ne sont pas adaptées pour mettre en évidence ces interactions soit ce sont des faux positifs. De la même manière que nous l’avons évoqué pour XPIAS1, il conviendrait de vérifier ces

résultats en recommencant le criblage avec pPC97-XBTBD6-∆BTB et/ou en utilisant les

techniques d’étude des interactions protéiques précédement citées, le GST pull down ou le TAP-TAG.

DISCUSSION et PERSPECTIVES

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