XBTBD6 appartient à une sous famille de protéines à domaine BTB-POZ

Au cours de nos travaux de recherche nous avons identifié le gène XBTBD6 codant pour une protéine de type BTB-POZ. Chez l’homme, cette protéine est un membre d’une sous famille appartenant à la famille des protéines de type BTB-POZ. Cette sous famille est constituée de deux groupes contenant d’une part les protéines HBTBD6 et HBTBD3 et d’autre part les protéines HBTBD1 et HBTBD2. Tous les membres de cette sous famille possèdent la même structure : une succession de domaine BTB-POZ, BACK et PHR.

Les protéines humaines HBTBD1 et HBTBD2 ont été caractérisées en partie. Leur localisation subcellulaire a été analysée en détail et il nous a semblé intéressant d’étudier la localisation subcellulaire des protéines XBTBD6 et XBTBD3. Les protéines HBTB1 et HBTBD2 ont été étudiées dans le laboratoire du Docteur P. D’Arpa. Leurs travaux ont montré que ces protéines sont colocalisées dans des corpuscules cytoplasmiques de nature indéterminée dans les cellules Hela, DU145, HCT-116, MCF-7, normal skin fibroblastes, NIH3T3 et les C2C12 (Xu et al., 2003). Nous avons observé que XBTBD6 est localisé dans des corpuscules cytoplasmiques dans les cellules Hela, CHO, U2OS et COS7. La protéine XBTBD3 est aussi localisée dans des corpuscules cytoplasmiques similaires dans les cellules COS7. Nous avons montré de plus que XBTBD6 colocalise avec HBTBD2 et HBTBD1 dans les cellules COS7. Ces données suggèrent que XBTBD6, XBTBD3, HBTBD2 et HBTBD1 colocalisent dans les mêmes corpuscules cytoplasmiques. Des études ultérieures devraient compléter ces travaux en confirmant expérimentalement la colocalisation probable de XBTBD6, XBTBD3 et XBTBD2 dans les mêmes corpuscules cytoplasmiques. Les travaux de Xu ont montré que dans le cas de HBTBD2, les corpuscules cytoplasmiques observables ne sont pas des inclusions de protéines dénaturées (Xu et al., 2003). Dans le cadre de son mémoire, V. Moers a tenté de définir la nature de ces corpuscules cytoplasmiques mais les résultats obtenus n’ont pas pu nous éclairer sur leur nature exacte. Le marqueur mitochondrial Mitotraker nous a permis d’observer qu’il ne s’agit pas de mitochondries. Un inhibiteur de protéasome n’induit pas la disparition de ces corpuscules, ce qui indique qu’il ne s’agit probablement pas d’une structure liant le complexe d’ubiquitination contenant XBTBD6 au protéasome 26S et nécessaire à son fonctionnement. La comparaison du

DISCUSSION et PERSPECTIVES

56 marquage du réticulum endoplasmique et de XBTBD6 ne donne pas non plus d’indications claires. Notons que les travaux effectués par Xu n’ont pas pu définir, eux non plus, la nature de ces corpuscules. Leurs travaux montrent comme nous que ce ne sont pas des mitochondries et de plus qu’il ne s’agit pas de composants du cytosquelette (Xu et al., 2003). D’autres travaux comparatifs devront être menés pour définir exactement la nature de ces corpuscules. L’observation de la fluorescence au microscope confocal avec un plus fort grossissement pourrait nous permettre de mieux dicerner ces structures. Ce serait des travaux à prévoir dans le cadre de la continuation de l’étude de XBTBD6 et des protéines apparentées.

Nous avons étudié les rôles respectifs dans la localisation subcellulaire des parties N-terminales et C-N-terminales de la protéine XBTBD6. Nous avons observé dans les cellules COS7, Hela et U2OS que la partie N-terminale contenant le domaine BTB-POZ est impliquée dans la localisation de XBTBD6 dans les corpuscules cytoplasmiques. Le mutant ne contenant que la partie C-terminale se retrouve exclusivement dans le noyau cellulaire de ces cellules. Nous avons montré que la partie N-terminale est impliquée dans l’association de XBTBD6 au complexe d’ubiquitination probablement via le domaine BTB-POZ. Cette donnée nous amène à supposer que la présence du mutant dans les corpuscules cytoplasmiques pourrait provenir de la concentration des complexes d’ubiquitination dans ces corpuscules.

L’analyse informatique de la séquence protéique codant la partie C-terminale ne permet pas de mettre en évidence la présence d’un signal de localisation nucléaire. Il se peut cependant qu’en générant le mutant de délétion un motif de localisation nucléaire soit découvert permettant ainsi l’orientation du mutant vers le noyau. Cela pourrait expliquer nos observations. Pour vérifier l’existence de ce motif de localisation nucléaire artéfactuel, il serait intéressant d’analyser la localisation subcellulaire de la partie C-terminale de XBTBD6 en éliminant de manière systématique 20 acides aminés. En effet un motif de localisation nucléaire consiste généralement en une courte séquence (souvent entre 4 et 8 acides aminés) riche en acides aminés chargés positivement parfois séparée en deux blocs de 2 à 4 acides aminés chacun, les 2 blocs étant séparés l’un de l’autre par 9 à 12 acides aminés (Conti et al., 1998). Nous pourrions ainsi déterminer par élimination si une séquence peptidique permet la localisation nucléaire. La localisation nucléaire de la partie C-terminale pourrait aussi nous laisser supposer que la cible de XBTBD6 dans le cadre de sa fonction supposée de protéine adaptatrice serait une protéine nucléaire. Cette hypothèse parait contradictoire avec la localisation de la protéine entière à moins qu’il existe un mécanisme cellulaire permettant

MEFs NHDFs NIH 3T3s

Figure 42 : Localisation subcellulaire de la protéine HCullin-3 dans différents types cellulaires. La localisation de la protéine HCullin-3 a été déterminée par immunocytochimie à l’aide d’anticorps anti-Cullin-3 Les noyaux déterminée par immunocytochimie à l aide d anticorps anti-Cullin-3. Les noyaux sont marqués au DAPI. La localisation de HCullin-3 diffère suivant le type cellulaire utilisé (Singer et al., 1999).

DISCUSSION et PERSPECTIVES

57 l’exportation vers le cytoplasme de la protéine cible. L’identification de la cible pourrait donc s’avérer un point important à éclaircir pour comprendre la localisation de XBTBD6 dans la cellule.

Nous avons observé que la protéine XBTBD6 est localisée d’une manière différente dans les types cellulaires Neuro2A, 518A2e et 9L. Dans ces cellules XBTBD6 est présent uniformément dans tout le cytoplasme. De plus nous remarquons que dans les cellules Neuro2A, XBTBD6 est présent dans les neurites en formation. Pour compléter l’analyse, il serait intéressant d’étudier la localisation des mutants de XBTBD6 dans ces cellules en générant ces constructions mutantes fusionnées à la GFP. Cependant ces différentes localisations cellulaires ont amené des questions supplémentaires : ces données sont elles physiologiques où sont elles les conséquences d’artefacts expérimentaux ? Les travaux concernant Cullin-3 peuvent suggérer que nos travaux ne sont pas des artefacts expérimentaux. En effet Singer a montré par immunocytochimie que la protéine Cullin-3

murine est localisée différemment dans les cellules MEFs, NHDFs et NIH3T3 (Figure 42)

(Singer et al., 1999). Il pourrait donc y avoir pour XBTBD6 comme pour Cullin-3 une localisation différente en fonction du type cellulaire considéré.

Le domaine BTB-POZ confère les propriétés biochimiques d’homodimérisation et d’hétérodimérisation avec d’autres protéines à domaines BTB-POZ (Collins et al., 2001). Nous avons montré que XBTBD6 possèdent les propriétés générales d’homodimérisation et d’hétérodimérisation des protéines BTB-POZ. Ces interactions sont probablement dues au domaine BTB-POZ contenu dans la partie N-terminale de la protéine. Pour confirmer cette hypothèse il serait intéressant de réaliser des tests d’interactions avec une protéine XBTBD6 délétée uniquement du domaine BTB-POZ.

Il a été montré que plusieurs protéines à domaines BTB-POZ interagissent avec l’ubiquitine ligase E3 Cullin-3 (Voir Introduction I.4). Certaines de ces protéines possèdent de plus un domaine BACK dont la fonction n’est pas connue or XBTBD6 et les protéines apparentées XBTBD3, XBTBD2 et HBTBD1 possèdent ce domaine. De plus l’interaction entre HBTBD1 et HCullin-3 a été montrée en immunoprécipitation par Furukawa (Furukawa et al., 2003). Enfin, nous avons montré que XBTBD6 comme XBTBD3 et XBTBD2 ont la propriété d’interagir avec XCullin-3. Ces données indiquent que la propriété biochimique d’interagir avec l’ubiquitine ligase Cullin-3 est commune à un groupe protéique qui possède des caractéristiques structurelles proches.

DISCUSSION et PERSPECTIVES

58 En conclusion les analyses structurelles, les observations des localisations subcellulaires, les propriétés biochimiques de XBTBD6 et de ses protéines apparentées

montrent que les gènes BTBD6/3 et BTBD1/2 forment deux sous groupes apparentés

appartenant à la famille des protéines à domaine BTB-POZ interagissant avec l’ubiquitine ligase Cullin-3.