Les protéines à domaine BTB-POZ

Le domaine BTB-POZ (Broad-complex, Tramtrack and Bric à brac and Pox virus and Zinc fingers) (Godt et al., 1993 ; Bardwell and Treisman, 1994) est un domaine d’environ 120 résidus d’acides aminés. Ce domaine est présent dans les protéines de nombreuses espèces indiquant une forte conservation au cours de l’évolution. Ce domaine a été initialement identifié dans un groupe de facteurs de transcription comprenant Ttk (Tramtrack) (Harrison and Travers, 1990), BR-C (Broad Complex) (DiBello et al., 1991), les protéines bab1 et bab2 (bric à brac1 et bric à brac2) (Godt et al., 1993), Bcl6 (B-cell lymphoma 6) (Ye et al., 1993) et PLZF (Promyelocytic Leukemia Zinc Finger) (Chen et al., 1993). La réalisation du projet de séquençage du génome humain a mis en évidence l’existence de 204 protéines distinctes contenant un domaine BTB-POZ. Environ 20% de ces protéines codent pour des facteurs de transcription à doigts à zinc, 20% codent pour des protéines contenant le motif Kelch de liaison à l’actine et une grande majorité reste sans classification nette. Nous nous intéresserons dans cette introduction essentiellement aux protéines à domaine BTB-POZ associé à un domaine à doigts à zinc ainsi qu’aux protéines contenant un domaine BTB-POZ associé à un domaine Kelch. Les protéines à domaine BTB-POZ associé à un domaine à

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21 doigts à zinc sont à l’origine de la découverte du domaine BTB-POZ et de la caractérisation de ses propriétés biochimiques. Le domaine BTB-POZ suscite l’intérêt grandissant de la communauté scientifique, une base de données spécialisée dans la compilation des séquences des protéines à domaine BTB-POZ est en cours d’élaboration par le laboratoire du docteur G. Privé de l’institut sur le cancer du « Princess Margaret Hospital » à Toronto. Cette base de

données est accessible sur Internet à l’adresse suivante :

(http://xtal.uhnres.utoronto.ca/prive/projects.htm).

La propriété biochimique commune des domaines BTB-POZ est de permettre des interactions entre protéines, ces interactions peuvent être l’homodimérisation ou l’hétérodimérisation avec des protéines contenant un domaine BTB-POZ (Collins et al., 2001). Il a aussi été montré que le domaine BTB-POZ pouvait permettre l’élaboration d’oligomères comme c’est le cas pour la protéine GAGA (Espinas et al., 1999). Les principaux travaux ayant permis de mettre en évidence les caractéristiques fonctionnelles de ce domaine proviennent de l’étude des domaines BTB-POZ des facteurs de transcription PLZF et Bcl6, facteurs contenant un domaine à doigts à zinc de type C2H2. Il a été montré que la dimérisation de PLZF, médiée par le domaine BTB-POZ, est nécessaire pour que le dimère acquière une conformation fonctionnelle (Licht et al., 1996). De plus, il a été montré que les domaines BTB-POZ des facteurs de transcription PLZF et Bcl6 peuvent recruter directement les co-répresseurs SMRT (Silencing Mediator of Retinoid and thyroid hormone) et N-CoR (Nuclear CoRepressor) qui sont des composants du complexe répresseur multi protéique mSin3A/HDAC (Hong et al., 1997 ; David et al., 1998 ; Ahmad et al., 2003). Cependant cette propriété n’est pas générale puisque les facteurs de transcription à domaine

BTB-POZ comme HIC (Hypermethylated In Cancer) et γFBP-B (γF1 Binding Protein

isoform B) agissent en tant que répresseur transcriptionnel sans interagir avec les co-répresseurs SMRT et N-CoR. Enfin des travaux complémentaires sur PLZF et Bcl6 ont montré que des mutations de résidus d’acides aminés dans les domaines BTB-POZ de ces protéines entraînent l’inhibition de leur activité transcriptionnelle. Ces données suggèrent que l’intégrité du domaine BTB-POZ est critique pour maintenir les fonctions protéiques (Melnick et al., 2002).

Les facteurs de transcription à domaine BTB-POZ sont impliqués dans un large éventail de fonctions biologiques. A titre d’exemple nous pouvons citer la protéine PLZF qui est un inhibiteur de la croissance cellulaire. Ce facteur de transcription bloque la prolifération et la différentiation des cellules myéloïdes (Shaknovich et al., 1998) en réprimant l’expression du gène codant pour le régulateur du cycle cellulaire cycline A (Yeyati et al.,

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22 1999). Nous pouvons citer aussi la protéine Bcl-6 qui est normalement exprimée dans les cellules B germinales et dans les cellules CD4+ (Cattoretti et al., 1995 ; Dhordain et al., 1995). Un lymphome peut résulter d’une expression persistante de Bcl-6. En effet, dans ce cas la différentiation des lymphocytes est bloquée, les cellules restent donc à un stade indifférenciée d’intense prolifération et sont alors soumises à un risque accru de mutation pouvant entrainer l’apparition du lymphome. Au niveau moléculaire, Bcl-6 inhibe directement la transcription des gènes codant pour l’antigène CD69, la cycline D2 et la

protéine régulatrice de MAP kinase MIP1 (MAP2K-Interacting Protein) (Shaffer et al.,

2000). Un autre exemple bien documenté est le facteur de transcription de drosophile GAGA codé par le gène Trithorax-like (Farkas et al., 1994). Le facteur GAGA a été initialement caractérisé comme activateur des gènes de drosophile engrailed et ultrabithorax (Soeller et al., 1988 ; Biggin and Tjian, 1988). En fait GAGA fonctionne comme un anti-répresseur en formant des oligomères qui vont modifier l’organisation structurelle de l’hétérochromatine. Le complexe GAGA se fixe, via les domaines à doigts à zinc, sur des séquences GAGA répétées et successives présentes dans les promoteurs des gènes cibles (Pedone et al., 1996). Cette association maintient la chromatine dans une configuration spatiale qui permettra aux facteurs de transcription de reconnaître les promoteurs des gènes cibles (Kerrigan et al., 1991 ; Ohtsuki and Levine, 1998). Certains de ces facteurs de transcription à domaine BTB-POZ sont impliqués dans le développement du système nerveux. C’est le cas du facteur de transcription de drosophile Tramtrack qui inhibe la neurogenèse en s’opposant à la différentiation neurale (Badenhorst, 2001). Au niveau moléculaire, Tramtrack coordonne le recrutement de complexes de déacétylation et de remodelage des nucléosomes entraînant l’inhibition de l’expression de gènes cibles (Badenhorst et al., 2002).

Les protéines à domaine BTB-POZ contenant un domaine de fonction inconnu dénommé BACK (BTB and C-terminal Kelch) et le motif répété Kelch de liaison à l’actine sont venues se placer au centre de l’intérêt des chercheurs depuis la découverte des fonctions adaptatrices des protéines Keap1 et gigaxonine au sein de complexes d’ubiquitination de type BTB-Cullin-3. Plusieurs protéines à domaine BTB-POZ, BACK et Kelch ont été partiellement caractérisées et la publication de ces résultats a permis d’appréhender leur fonction. Plusieurs exemples illustrent ce type de réflexions. Il a été montré que la protéine murine mgcl-1 (mouse germ cell-less1), protéine à domaine BTB-POZ, BACK et Kelch caractérisée chez la drosophile sous le nom de Gcl est impliquée dans la régulation de la protéine p53 en induisant la dégradation de la protéine Mdm2 (Masuhara et al., 2003). Or Furukawa a montré en double hybride en levure et en immunoprécipitation que Gcl interagit

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23 avec Cullin-3 (Furukawa et al. 2003). Ainsi il est tentant de supposer que mgcl-1 est une protéine adaptatrice appartenant au groupe de protéines à domaines BTB-POZ, BACK et Kelch dans un complexe d’ubiquitination de type BTB-Cullin-3 dont la fonction serait l’ubiquitination et la dégradation de la protéine Mdm2. De la même manière, la protéine actinfillin est une protéine à domaines BTB-POZ, BACK et Kelch exprimée dans la plupart des neurones du cerveau de rat. Par la technique du double hybride en levure, il a été montré que actinfillin interagit avec la protéine Cap70 qui joue un rôle important dans l’organisation du cytosquelette des neurones (Chen et al., 2002). Des travaux complémentaires par le même auteur consistant à induire d’une part la surexpression et d’autre part la perte de fonction de la protéine actinfillin montrent qu’elle régule l’activité de Cap70 (Chen and Li, 2005). Bien que l’interaction entre actinfillin et Cullin-3 n’est pas été démontré, il est tentant de supposer que actinfillin est une protéine adaptatrice appartenant au groupe des protéines à domaines BTB-POZ, BACK et Kelch appartenant à un complexe d’ubiquitination de type BTB-Cullin-3 dont la fonction serait l’ubiquitination et la dégradation de la protéine Cap70. Pour notre étude il est intéressant de citer la protéine NRP/B (Nuclear Restricted Protein/Brain) qui est une protéine qui présente aussi la succession des différents domaines BTB-POZ, BACK et Kelch. NRB/P est exprimée dans les neurones mais pas dans les astrocytes et constitue un marqueur précoce des neurones en différentiation dans le système nerveux en développement. De plus NRP/B interagit avec la protéine p110^RB (Retinoblastome Protein 110) qui est une protéine qui régule la progression du cycle cellulaire et est importante pour la différentiation (Kim et al., 1998). Là encore il est possible que NRP/B soit un autre exemple de protéine adaptatrice à domaines BTB-POZ, BACK et Kelch.

Les travaux de Furokawa sont d’un intérêt tout particulier concernant ce groupe de protéines. Outre le fait qu’ils montrent en double hybride en levure et en immunoprécipitation l’interaction de mgcl-1 et de gigaxonine avec Cullin-3, il montre aussi que 7 autres protéines interagissent avec Cullin-3. Rien n’est connu sur ces protéines mais chacune présentent la succession des domaines BTB-POZ, BACK et Kelch, il s’agit des protéines Klhl-13, Klhl-9, Klhl-21, Klhl-3, Klhl-15. Klhl-2 et Klhl-x. Ces données tendent à confirmer que la famille des protéines à domaines BTB-POZ, BACK et Kelch constitue un groupe de protéines capables d’interagir avec Cullin-3 et qui ont probablement le rôle de protéine adaptatrice.

Cependant Furukawa montre aussi que la protéine humaine BTBD1 interagit avec Cullin-3 or celle ci est le seul exemple étudié de protéine ne présentant que les domaines BTB-POZ et BACK sans le domaine Kelch (Furukawa et al., 2003). BTBD1 fait partie des

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24 8 protéines détectées dans le génome humain qui sont enregistrées dans la base de données informatique compilant des séquences des protéines à domaine BTB-POZ, disponible à l’adresse http://xtal.uhnres.utoronto.ca/prive/back.html et qui possèdent les domaines

BTB-POZ et BACK sans le domaine Kelch (Figure 13) (Stogios and Privé, 2004). Nous verrons

qu’à la suite de nos travaux il est nécessaire d’en ajouter deux de plus, BTBD3 et BTBD6. Sur les 8 protéines, il n’y a que BTBD1 et BTBD2 qui sont partiellement caractérisées. Ces deux protéines sont apparentées puisqu’elles présentent une identité de séquence en résidus d’acides aminés de 76%. Elles ont été caractérisées simultanément dans un criblage en double hybride en levure comme des partenaires de la topoisomérase 1 (Xu et al., 2002). Une étude fonctionnelle sur BTBD1 a consisté à générer un clone stable à partir de myoblastes exprimant la protéine BTBD1 délétée de la partie N-terminale contenant les domaines BTB-POZ et BACK. Il a été montré que la partie C-terminale bloque la différenciation des myoblastes en myotubes (Pisani et al., 2004). Enfin, la partie C-terminale de BTBD1 et BTBD2 présente un domaine de fonction inconnue appelé PHR (PAM-Highwire-Rpm1) que l’on trouve en deux copies dans les produits des gènes PAM, Highwire et Rpm1. Ce sont les gènes orthologues pour respectivement les espèces H. sapiens, D. melanogaster et C. elegans

codant pour une protéine de type ubiquitine ligase E3 dont nous allons parler dans le chapitre suivant.