Analyse de la séquence de l’ADNc XBTBD6

Nous avons déterminé que la séquence nucléotidique du clone d’ADN

complémentaire (ADNc) du gène XBTBD6 isolé comprend 2305 paires de bases (pb). Il y a

plusieurs codons ATG pouvant potentiellement être le codon initiateur de la traduction. Le codon dont l’adénine est numérotée 433 est le meilleur candidat pour être le codon initiateur

Figure 16 : Séquence protéique potentielle de XBTBD6.La séquence de XBTBD6 est déduite de la traduction de l’ADNc de 2305 pb que nous avons séquencé. L’ORF le plus probable de 1554 pb présent dans la séquence nucléotidique a été traduit en résidus d’acides aminés correspondants. L’UTR en 5’ précédant le codon initiateur contient 6 codons stop indiqués en gras.

RESULTATS

30 de la traduction puisqu’il se trouve au sein d’un environnement correspondant le plus au consensus de Kozak. Nous avons ainsi déterminé une phase ouverte de lecture (ORF) de 1554 pb précédée par une région non traduite (UTR) de 273 pb qui contient 6 codons stop en phase. La fin de l’ORF se termine par un codon TGA. Or il a été montré que le codon TGA pouvait coder, jusqu’à présent uniquement dans des enzymes, pour l’acide aminé sélénocystéine si dans la région du 3’UTR se trouve une séquence de type SECIS (Selenocystein Insertion Sequense) (Walczak et al., 1997). L’analyse informatique de la séquence nucléotidique de l’ADNc de XBTBD6 n’indique pas la présence de séquence SECIS et l’analyse de la séquence protéique prédite ne permet pas de déterminer la présence d’un site enzymatique. Nous pouvons ainsi supposer que le codon TGA est bien le codon de terminaison de la traduction. Nous n’avons pas déterminé de site de polyadénylation dans la région 3’UTR, il est donc possible que la séquence polyadénylée présente dans notre séquence ne soit pas la queue polyA. Nous avons donc probablement la séquence codante pour XBTBD6 mais nous n’avons pas la totalité de la séquence de l’ADNc (Figure 16).

L’analyse informatique de la séquence protéique prédite de XBTBD6 révèle la présence dans la moitié N-terminale d’un domaine BTB-POZ. Ce domaine, d’une longueur de 116 acides aminés, est impliqué dans les interactions entre protéines. Il a été décrit que le domaine BTB-POZ permet l’homodimérisation ainsi que dans certains cas l’hétérodimérisation avec d’autres protéines possédant un domaine BTB-POZ (Collins et al., 2001). De plus il a été montré que ce domaine permet l’interaction avec l’ubiquitine ligase E3 Cullin-3 (Pintard et al., 2003). Le domaine BTB-POZ dans la protéine XBTBD6 est immédiatement suivi par un domaine sans fonction connue appelé BACK souvent trouvé de pair avec le domaine BTB-POZ en particulier dans les protéines à domaine BTB-POZ, BACK et Kelch. Notons que XBTBD6 ne présente pas de domaine de type Kelch. Dans la moitié C-terminale se trouve un domaine de type PHR (PAM-Highwire-Rpm1) dont la fonction n’est pas connue à ce jour. Il n’y a pas dans la littérature de donnée concernant la

fonction du gène XBTBD6. Il existe uniquement un article rapportant une analyse

systématique d’EST de cristallin humain où est cité le gène BTBD6 humain dénommé dans ce travail LBDP (Lens BTB Domain Protein) (Wistow et al., 2002). Notons l’existence d’un article présentant la caractérisation d’un EST de xénope nommé P7E4 découvert lors d’un criblage de gènes exprimés dans le mésoderme antérieur d’embryons de xénope et dont la

séquence correspond parfaitement à 687 acides nucléiques de l’ADNc de XBTBD6 (Shibata

et al., 2001). Cependant l’analyse du profil d’expression en hybridation in situ de l’EST présenté dans cet article ne correspond en rien à nos résultats. Il est donc probable que la

H. sapiens P. troglodytes M. musculus R. norvegicus X. Laevis D. rerio D melanogaster D. melanogaster A. gambiae C. intestinalis C. elegans H. sapiens P. troglodytes M. musculus R. norvegicus X. Laevis D. rerio D. melanogaster A. gambiae C. intestinalis C. elegans H. sapiens P. troglodytes M. musculus R. norvegicus X. Laevis D. rerio D. melanogasterg A. gambiae C. intestinalis C. elegans H. sapiens P. troglodytes M. musculus R. norvegicus X. Laevis D. rerio D. melanogaster Domaine BTB-POZ A. gambiae C. intestinalis C. elegans H. sapiens P. troglodytes M. musculus R. norvegicus X. Laevis D. rerio D. melanogaster Domaine BACK D. melanogaster A. gambiae C. intestinalis C. elegans H. sapiens P. troglodytes M. musculus R. norvegicus X. Laevis D. rerio D. melanogaster Acides aminés 538 518 538 539 517 523 677 Domaine PHR g A. gambiae C. intestinalis C. elegans 607 479 602

Figure 17 : Alignement des séquences protéiques de la protéine BTBD6 de différentes espèces. Les résidus d’acides aminés identiques sont encadrés en noir. Le domaine BTB-POZ est souligné par le trait plein, le domaine BACK est souligné par le trait en tirets et le domaine PHR est souligné par le trait en pointillés. La protéine de xénope présente une identité de séquence en résidus d’acides aminés de 78% avec les protéines BTBD6 humaine (Q96KE9), simienne (XP518445), murine (NP_964008) et de rat (XM234576), de 83,4% avec une protéine du poisson zèbre (CAH68989), de 44,9% avec une protéine de la drosophile (NM_142361), de 49,8% avec une protéine du moustique A. gambiae (XM313147), de 53,4% avec une protéine de l’urochordé C. intestinalis (AK112461) et de 32,7% avec une protéine du ver C. elegans(NM069843). Ces données indiquent que ce gène a été particulièrement bien conservé au cours de l’évolution des vertébrés.

Figure 18 : Arbre phylogénétique comprenant les différents membres du sous-groupe des protéines à domaine BTB POZ de la famille BTBD chez l’homme et le groupe des protéines à domaine BTB-POZ de la famille BTBD chez l’homme et le xénope.Ce dendrogramme montre que les protéines de xénope BTBD6, BTBD3, BTBD2 et BTBD1 sont proches des orthologues humains et définissent deux groupes distincts constitués par BTBD1/2 et BTBD3/6 (Arbre généré par le logiciel DNASTAR Lasergene99 méthode Clustal. Les unités indiquent le nombre de substitutions pour 100 acides aminés) (Hs :Homo sapiens, Xl :Xenopus laevis, Xt :Xenopus tropicalis).

RESULTATS

31 sonde utilisée dans le travail publié ne corresponde pas à la séquence de l’EST P7E4. Nous avons contrôlé nos résultats en séquençant systématiquement nos constructions plasmidiques. L’analyse du profil d’expression en hybridation in situ présentée dans cette étude a été effectuée plusieurs fois avec des sondes ARN antisens générées à partir de l’EST XL013k12

contenant toute la séquence de l’ADNc. De plus, nous avons effectué des expériences

d’hybridation in situ à partir de la séquence codante du gène XBTBD6 ainsi qu’à partir de deux séquences contenant l’une les 759 premiers acides nucléiques et l’autre les 795 derniers de XBTBD6. Dans chaque cas les résultats sont identiques prouvant que nous sommes bien en présence de la même sonde ciblant le même transcrit du gène XBTBD6.

L’analyse informatique comparative de la séquence protéique de XBTBD6 avec les séquences protéiques contenues dans les bases de données informatiques nous indique une identité de séquence en résidus d’acides aminés de 78% avec les protéines BTBD6 humaine, simienne, murine et de rat. De plus nous observons 83,4% d’identité avec une protéine du poisson zèbre, 44,9% avec une protéine de la drosophile, 49,8% avec une protéine du moustique A. gambiae, 53,4% avec une protéine de C. intestinalis et 32,7% avec une protéine du ver C. elegans (Figure 17). L’alignement montre que les séquences des domaines BTB-POZ chez l’homme, le chimpanzé, la souris, le rat, le poisson zèbre et le xénope sont identiques à 74%, les domaines BACK sont identiques à 80,6% et les régions similaires au domaine PHR sont identiques à 89,7%. Ces données indiquent que ce gène a été particulièrement bien conservé au cours de l’évolution des vertébrés. De plus nous avons observé que la protéine XBTBD6 présente 69% d’identité avec la protéine XBTBD3. De la même manière la protéine humaine BTBD6 (HBTBD6) présente 67% d’identité avec la

protéine humaine BTBD3 (HBTBD3). Ces deux gènes BTBD6 et BTBD3 forment un groupe

très proche structurellement d’un autre groupe formé par les gènes BTBD1 et BTBD2. La protéine humaine BTBD1 (HBTBD1) présente 71% d’identité avec la protéine humaine

BTBD2 (HBTBD2). Nous avons pu déterminer dans les bases de données du Xenopus laevis

la séquence de XBTBD2 mais pas la séquence de XBTBD1. Néanmoins nous avons trouvé

dans les banques d’EST du Xenopus tropicalis une séquence codant pour XtBTBD1.

XBTBD6 présente 43% d’identité avec XBTBD2 et 42% avec XtBTBD1. Les protéines XtBTBD1, XBTBD2 et XBTBD3 présentent la même structure que XBTBD6 avec la succession du domaine BTB-POZ suivit par le domaine BACK et la présence de la région similaire au domaine PHR dans la partie C-terminale. Nous avons généré un dendogramme en utilisant les séquences des différents membres des protéines BTBD que nous avons identifiés chez l’homme et le xénope (Figure 18). Ces comparaisons suggèrent l’existence de

XBTBD6-GFP HOECHST FUSION

COS7

A

FLAG-XBTBD6 HOECHST FUSION

B

FLAG-XBTBD6-Nterm HOECHST FUSION

C

FLAG-XBTBD6-Cterm HOECHST FUSION

D

Figure 19 : Localisation subcellulaire de la protéine XBTBD6 et des mutants XBTBD6 Nterm. et XBTBD6 Cterm. en cellules COS7.Les cellules COS7 ont été transfectées avec les différentes constructions puis cultivées deux jours. Les cellules sont traitées suivant le type de construction t f té ( it i t hi i ti lé à l FITC it transfecté (soit pour un marquage immunocytochimique avec un anticorps couplé à la FITC soit pour l’observation directe de la GFP) puis placées pour l’observation microscopique. (A et B) Les résultats montrent que la protéine XBTBD6 aussi bien en fusion avec la GFP qu’avec un épitope FLAG est localisée dans le cytoplasme dans des corpuscules cytoplasmiques. (C) Le mutant de délétion correspondant à la partie N-terminale de la protéine XBTBD6 est localisé comme la protéine entière dans des corpuscules cytoplasmiques. (D) Le mutant de délétion correspondant à

MYC-XBTBD3 HOECHST FUSION

A

Figure 20 : Localisation subcellulaire de la protéine XBTBD3 en cellules COS7.Les cellules COS7 ont été transfectées avec les différentes constructions puis cultivées deux jours. Les cellules sont traitées pour un marquage immunocytochimique avec un anticorps couplé à la FITC puis placées pour l’observation microscopique. (A) Les résultats montrent que la protéine XBTBD3 en fusion avec un épitope FLAG est localisée dans le cytoplasme dans des corpuscules cytoplasmiques.

RESULTATS

32 2 groupes de gènes constitués par BTBD1/2 et BTB3/6 appartenant à une sous famille de gènes au sein de la grande famille des gènes codant pour des protéines à domaine BTB-POZ.