Caractérisation du gène XBTBD6 codant pour une protéine à domaine BTB-POZ impliquée dans la neurogenèse chez le xénope

UNIVERSITE LIBRE DE BRUXELLES

Faculté des Sciences

Département de Biologie moléculaire - Laboratoire d’Embryologie Moléculaire

Promoteur de Thèse : Pr. E. Bellefroid

Caractérisation du gène XBTBD6

codant pour une protéine à domaine BTB-POZ impliquée dans la neurogenèse chez le xénope

Thèse présentée en vue de l’obtention du grade de Docteur en Sciences BURY Frédéric

Année académique 2005-2006

Caractérisation du gène XBTBD6

codant pour une protéine à domaine BTB-POZ impliquée dans la neurogenèse chez le xénope

Thèse présentée en soutenance privée le 17 février 2006 et en soutenance publique le 19 mai 2006 devant le jury composé des :

Prof. J. URBAIN Président

Prof. J. ROSCAM-SZPIRER Secrétaire

Prof. C. SZPIRER Rapporteur

Prof. D. CHRISTOPHE Rapporteur

Prof. B. PEERS Expert extérieur

Prof. E. BELLEFROID Directeur de Thèse

BURY Frédéric

Département de Biologie moléculaire - Laboratoire d’Embryologie Moléculaire

Caractérisation du gène XBTBD6 codant pour une protéine à domaine BTB-POZ impliquée dans la neurogenèse chez le xénope.

A la suite d’un criblage in silico nous avons identifié un nouveau gène codant pour une protéine à domaine BTB-POZ, XBTBD6.

Nous avons déterminé que la protéine XBTBD6 est une protéine cytoplasmique. Dans les cellules Hela, CHO, U2OS et COS7 la protéine XBTBD6 est localisée dans des corpuscules cytoplasmiques, localisation similaire à celle des protéines XBTBD3, HBTBD1 et HBTBD2. Nous avons observé que la partie N-terminale de la protéine, contenant le domaine BTB-POZ, est localisée dans la cellule comme la protéine entière ; par contre la partie C-terminale est exclusivement nucléaire. De plus, nous avons observé que XBTBD6 est localisée de façon diffuse dans le cytoplasme des cellules Neuro2A, 9L et 518A2e. Nous avons montré que la protéine XBTBD6 homodimérise et hétérodimérise avec XBTBD3 et XBTBD2 et qu’elle interagit avec l’ubiquitine ligase E3 XCullin-3. L’ensemble de ces interactions nécessite la présence du domaine BTB-POZ. Ces données montrent que les protéines BTBD6, BTBD3, BTBD1 et BTBD2 possèdent des propriétés communes indiquant qu’elles appartiennent à un sous groupe de la famille des protéines à domaine BTB-POZ.

Le profil d’expression a été analysé par la technique de protection à la RNAse et par hybridation in situ. Les résultats montrent que ce gène est fortement exprimé dans le système nerveux adulte et embryonnaire. Des expériences de surexpression par micro-injection d’ARNm ont permis de placer le gène XBTBD6 dans la cascade d’activation des gènes proneuraux en aval de XNgnr-1, XNeuroD, Xath3 et Xebf3. Ces résultats montrent que XBTBD6 est un marqueur neuronal chez le xénope.

Au cours de l’étude de la fonction du gène XBTBD6, nous avons montré que la surexpression et la perte de fonction de ce gène dans l’embryon de xénope n’induit pas de variation du nombre de neurones dans la plaque neurale. Par contre nous avons observé que la surexpression du gène XBTBD6 dans des cellules Neuro2A en différentiation régule négativement la croissance des neurites.

Nous avons élaboré un modèle de fonctionnement biochimique hypothétique où la protéine XBTBD6 fonctionnerait comme protéine adaptatrice dans un complexe d’ubiquitination permettant l’ubiquitination d’une protéine cible. Nous avons recherché les partenaires potentiels de XBTBD6 en utilisant la technique du double hybride en levure mais sans y parvenir.

Remerciements

1

Remerciements

Je remercie l’ULB pour m’avoir accueillie dans son honorable institution au sein des laboratoires de l’IBMM.

Je salue chaleureusement tous les membres du laboratoire d’embryologie moléculaire que j’ai croisés pendant ces années de travail : Kaki, Sadia, Vincent, Pierre, Flavio, Ludivine, Angela, Gilles, Sarah, Massimo et Virginie ainsi que ceux des autres laboratoires : Françoise, Réginald et tous ceux que j’ai, par inadvertance, pu oublier.

Un remerciement particulier pour mon épouse qui m’a soutenu durant cette longue période et une pensée pour ma petite fille Marie. Enfin merci à ma famille pour son soutien lointain mais réconfortant.

Frédéric BURY

French

117 Avenue Vanderaey, 1180 Bruxelles - BELGIUM + 32 (0)2 375 78 71

f.bury@free.fr

PhD - BIOLOGIST

EXPERIENCE

2001 / 2006 PhD student at ULB-IBMM (Gosselies, CHARLEROI, BELGIUM)

► Thesis title: Characterization of XBTBD6 gene coding for a BTB-POZ protein implicated in xenopus neurogenesis.

2000 / 2001 RESEARCH SCIENTIST in screening at AVENTIS (Vitry Alfortville, PARIS, FRANCE)

► Development of biological test for HTS:

Used fluorophores to study diverse molecular and cellular events with the ACUMEN Explorer, a fluorescence detector under development.

● Specific apoptosis probes (JC-1, Annexin-V conjugated with FITC or PE, Iodide Propidium, PhiPhiLux) were used to develop a generic apoptosis assay detected by the ACUMEN system.

● An antibody conjugated with FITC was used to recognize a specific surface marker present on tumoral cells in aim to develop an assay for secondary screening process with the ACUMEN detector.

1998 / 1999 RESEARCH SCIENTIST in screening at GLAXOWELLCOME (Les Ulis, PARIS, FRANCE)

► Development and processing of secondary screening :

Developed four biological tests in order to find an activator of the TGFb1 transduction pathway.

► Research on the transcription factors implicated in the inhibiting effect of the TGFb1 on the Collagenase-1 promotor :

Studied the promoter behavior under the action of different cytokines and transcription factors.

PUBLICATIONS

BURY J. F., MOERS V. and BELLEFROID E. XBTBD6 encoding a XCullin-3 interacting protein is expressed during neurogenesis in Xenopus laevis. (In preparation)

MOERS V., BURY J. F. and BELLEFROID E. The XDMRT5 gene encoding a zinc finger transcription factor is highly expressed in the forebrain and olfactory placodes. (In preparation)

SEMINARS

June 2005 Poster presentation at the Belgian Society for Neuroscience meeting in the UCL, Belgium Faculty of Medicine. “XBTBD6 encoding a XCullin-3 interacting protein is expressed during neurogenesis in Xenopus laevis.

May 2005 Poster presentation at the PAI meeting in the UCL, Belgium Faculty of Medicine. “XBTBD6 encoding a XCullin-3 interacting protein is expressed during neurogenesis in Xenopus laevis.

March 2001 Poster presentation at the Screentech Conference in San Diego (USA). “Cell surface antigen detection using the ACUMEN Explorer”

EDUCATION

2006 PhD. in Biological Science, ULB-IBMM, Gosselies, CHARLEROI, BELGIUM.

2001 Ingénieur en Génie Biologique, CNAM School of PARIS (Master of Science in Biological Engineering) 1996 Maîtrise de Biologie Cellulaire, University of LIMOGES, FRANCE (Bachelor of Science in Cellular Biology) 1993 DEUG des Sciences de la vie, University of LIMOGES, FRANCE (Associate in Life Sciences)

LANGUAGE

French (native language) English (advanced)

SKILLS

Good knowledge in computers (Microsoft softwares, vectorNTI, Reference Manager, Chromas)

Military service in 1993/1994 : seargent (Caporal Chef) in Communications (Transmissions) in French Army Archeology (Excavation at gallo-roman and medieval sites) and drawing

Sport (fitness and jogging)

Sommaire

2

Sommaire

Remerciements ... 1

Sommaire ... 2

Résumé ... 5

Liste des abréviations ... 6

I. INTRODUCTION ... 7

I.1. Le modèle xénope ... 7

I.2. Le développement embryonnaire du xénope ... 8

I.2.1. Les premières étapes du développement ... 8

I.2.2. L’induction neurale chez le xénope ... 8

I.2.3. Les bases moléculaires de l’induction neurale chez le xénope ... 9

I.2.4. La neurogenèse primaire ... 11

I.2.5. Le contrôle de la neurogenèse primaire chez le xénope ... 12

I.2.5.1. La cascade d’activation des gènes proneuraux ... 12

I.2.5.2. L’inhibition latérale ... 13

I.3. Un système de régulation des mécanismes biologiques : l’ubiquitination. ... 14

I.3.1. L’ubiquitination ... 14

I.3.2. La cascade d’ubiquitination ... 15

I.3.3. Les protéines ubiquitine ligases E3 à domaine de type RING ... 15

I.3.4. Les complexes de type SCF ... 16

I.3.5. Les complexes de type BTB-Cullin-3 ... 18

I.4. Les protéines à domaine BTB-POZ ... 20

I.5. L’implication du système d’ubiquitination dans la croissance des neurites. ... 24

II. BUT DU TRAVAIL ... 28

III. RESULTATS ... 29

III.1. Identification de la protéine de xénope XBTBD6 ... 29

III.1.1. Criblage in silico de la base de données informatiques TIGR ... 29

III.1.2. Analyse de la séquence de l’ADNc XBTBD6 ... 29

III.1.3. Localisation subcellulaire de la protéine XBTBD6 ... 32

III.1.3.1. Localisation de XBTBD6 et XBTBD3 dans les cellules COS7 ... 32

III.1.3.2. Localisation de XBTBD6 dans les cellules Hela, CHO, U2OS, Neuro2A,518A2e et 9L ... 33

III.1.4. Colocalisation de XBTBD6 avec HBTBD1 et HBTBD2 ... 33

III.1.4.1. Le domaine BTB-POZ est requis pour la localisation de XBTBD6 dans les corpuscules cytoplasmiques ... 34

III.1.5. XBTBD6 homodimérise et hétérodimérise avec XBTBD3 et XBTBD2 ... 35

III.1.6. XBTBD6, XBTBD3 et XBTBD2 interagissent avec XCullin-3. ... 36

III.1.6.1. Analyse des interactions par immunoprécipitation ... 36

III.1.6.2. Localisation de XBTBD6, XBTBD3 et XCullin-3 dans le cytoplasme des cellules COS7 ... 37

III.2. Expression du gène XBTBD6 ... 37

III.3. Régulation du gène XBTBD6 ... 39

III.4. Etude du rôle de XBTBD6 au cours de la neurogenèse ... 41

Sommaire

3 III.4.1. La modulation de l’expression de XBTBD6 n’induit pas de modification du

nombre de neurones primaires. ... 41

III.4.2. La surexpression de XBTBD6 régule négativement la croissance des neurites .... 44

III.5. Recherche de partenaires protéiques de XBTBD6 par criblage par double hybride en levure. ... 46

III.5.1. Utilisation des vecteurs appâts pPC97-XBTBD6, pPC97-XBTBD6 N-term et pPC97-XBTBD6 C-term. ... 46

III.5.2. Utilisation du vecteur appât pPC97-XBTBD6-∆BTB ... 50

IV. DISCUSSION et PERSPECTIVES ... 55

IV.1. XBTBD6 appartient à une sous famille de protéines à domaine BTB-POZ ... 55

IV.2. Le gène XBTBD6 est un marqueur de la neurogenèse chez le xénope. ... 58

IV.3. Etude de la fonction de XBTBD6 dans la neurogenèse ... 59

IV.3.1. La protéine XBTBD6 pourrait fonctionner comme protéine adaptatrice dans un complexe d’ubiquitination de type BTB-Cullin-3. ... 59

IV.3.2. XBTBD6 régule la croissance des neurites, par quel mécanisme ? ... 62

IV.3.3. Les protéines cibles de XBTBD6 restent inconnues. ... 64

IV.4. Perspectives ... 66

V. ANNEXES ... 68

V.1. MATERIELS ET METHODES ... 68

V.1.1. Matériels ... 68

V.1.1.1. Plasmides utilisés ... 68

V.1.1.1.1. Les linéarisations pour les générations des ARNm synthétique micro- injectables ... 73

V.1.1.1.2. Les linéarisations pour les générations des ARN antisens pour les hybridations in situ ... 65

V.1.1.2. Produits, milieux et solutions utilisés ... 73

V.1.1.2.1. Produits ... 73

V.1.1.2.2. Milieux de culture ... 75

V.1.1.2.3. Solutions ... 75

V.1.2. Méthodes ... 78

V.1.2.1. Préparation, purification et analyse des ADN plasmidiques ... 78

V.1.2.1.1. Clonage ... 78

V.1.2.1.2. Préparation des bactéries électrocompétentes ... 79

V.1.2.1.3. Transformation, étalement et sélection des bactéries ... 79

V.1.2.1.4. Préparation d’ADN plasmidique à partir d’une culture bactérienne ... 79

V.1.2.1.5. Préparation d’ADN plasmidique à partir d’une culture de levure ... 80

V.1.2.1.6. Analyse par électrophorèse sur gel d’agarose ... 80

V.1.2.1.7. Purification par phénol/chloroforme ... 80

V.1.2.1.8. Séquençage ... 80

V.1.2.2. Préparation, purification et analyse des ARN ... 81

V.1.2.2.1. Synthèse d’ARNm synthétique pour injection en embryons de xénope ... 81

V.1.2.2.2. Synthèse d’ARN antisens marqué à la digoxigénine pour hybridation in situ ... 81

V.1.2.2.3. Extraction des ARN totaux d’embryons et de tissus de xénope ... 81

V.1.2.2.4. Analyse par protection à la RNAse (RPA) ... 82

V.1.2.3. Préparation, purification et analyse des protéines ... 83

Sommaire

4

V.1.2.3.1. Extraction de protéines et Immunoprécipitation (IP) ... 83

V.1.2.3.2. Analyse par Western Blot ... 84

V.1.2.4. Manipulations sur levures ... 84

V.1.2.4.1. Culture de levures en milieux solides ou liquides ... 84

V.1.2.4.2. Transformation de levures par la méthode à l’acétate de lithium ... 84

V.1.2.4.3. Sélection par test colorimétrique X-Gal ... 85

V.1.2.4.4. Criblage de double hybride en levures ... 85

V.1.2.5. Manipulations sur embryons de xénopes ... 85

V.1.2.5.1. Obtention d’embryons de xénopes ... 85

V.1.2.5.2. Micro-injections d’ARNm synthétique en embryons de xénopes ... 86

V.1.2.5.3. Préparation des calottes animales ... 86

V.1.2.5.4. Fixation des embryons et coloration X-gal ... 86

V.1.2.5.5. Hybridation in situ sur embryons de xénopes ... 86

V.1.2.5.6. Emballage en gélatine et section au vibratome des embryons ... 87

V.1.2.6. Manipulations sur cellules en culture ... 88

V.1.2.6.1. Culture cellulaire et transfection transitoire ... 88

V.1.2.6.2. Immunocytochimie ... 88

V.2. BIBLIOGRAPHIE ... 89

V.3. PUBLICATION ... 101

Résumé

5

Résumé

A la suite d’un criblage in silico nous avons identifié un nouveau gène codant pour une protéine à domaine BTB-POZ, XBTBD6.

Nous avons déterminé que la protéine XBTBD6 est une protéine cytoplasmique. Dans les cellules Hela, CHO, U2OS et COS7 la protéine XBTBD6 est localisée dans des corpuscules cytoplasmiques, localisation similaire à celle des protéines XBTBD3, HBTBD1 et HBTBD2. Nous avons observé que la partie N-terminale de la protéine, contenant le domaine BTB-POZ, est localisée dans la cellule comme la protéine entière ; par contre la partie C-terminale est exclusivement nucléaire. De plus, nous avons observé que XBTBD6 est localisée de façon diffuse dans le cytoplasme des cellules Neuro2A, 9L et 518A2e. Nous avons montré que la protéine XBTBD6 homodimérise et hétérodimérise avec XBTBD3 et XBTBD2 et qu’elle interagit avec l’ubiquitine ligase E3 XCullin-3. L’ensemble de ces interactions nécessite la présence du domaine BTB-POZ. Ces données montrent que les protéines BTBD6, BTBD3, BTBD1 et BTBD2 possèdent des propriétés communes indiquant qu’elles appartiennent à un sous groupe de la famille des protéines à domaine BTB-POZ.

Le profil d’expression a été analysé par la technique de protection à la RNAse et par hybridation in situ. Les résultats montrent que ce gène est fortement exprimé dans le système nerveux adulte et embryonnaire. Des expériences de surexpression par micro-injection d’ARNm ont permis de placer le gène XBTBD6 dans la cascade d’activation des gènes proneuraux en aval de XNgnr-1, XNeuroD, Xath3 et Xebf3. Ces résultats montrent que XBTBD6 est un marqueur neuronal chez le xénope.

Au cours de l’étude de la fonction du gène XBTBD6, nous avons montré que la surexpression et la perte de fonction de ce gène dans l’embryon de xénope n’induit pas de variation du nombre de neurones dans la plaque neurale. Par contre nous avons observé que la surexpression du gène XBTBD6 dans des cellules Neuro2A en différentiation régule négativement la croissance des neurites.

Nous avons élaboré un modèle de fonctionnement biochimique hypothétique où la protéine XBTBD6 fonctionnerait comme protéine adaptatrice dans un complexe d’ubiquitination permettant l’ubiquitination d’une protéine cible. Nous avons recherché les partenaires potentiels de XBTBD6 en utilisant la technique du double hybride en levure mais sans y parvenir.

Liste des abréviations

6

Liste des abréviations

3-AT 3-Amino-1,4-Triazole MAP Microtubule Associated Protein ARN Acide RiboNucléique MAP1b Microtubule Associated Protein 1b

ARNm Acide RiboNucléique messager MAPK Mitogen-Activated PhosphoKinases ADN Acide DésoxyriboNucléique MEF Mouse Embryonic Fibroblast

ADNc Acide DésoxyriboNucléique

complémentaire mgcl-1 mouse germ cell-less1

AES Amino-terminal Enhancer of Split Milieu LB Milieu Luria Bertani APC/C Anaphase Promoting

Complex/Cyclosome

Milieu YPD Milieu Yeast Peptone Dextrose ASF1 AntiSilencing Function 1 Milieu YT Milieu Yeast Triptone

bab1 bric à brac 1 MIP1 MAP2K-Interacting Protein 1

bab2 bric à brac 2 MIR MRLC Interacting Protein

Bcl6 B-cell lymphoma 6 MYL2 Myosin regulatory light chain 2

bHLH basic Helix Loop Helix MYO1C Myosin 1C

BMB Boehringer Mannheim Blocking MYβHC Cardiac Myosin β Heavy Chain BMP4 Bone Morphogenetic Protein 4 N-CoR Nuclear CoRepressor

BR-C Broad Complex NHDF Normal Human Dermal Fibroblast

BSA Albumine de Sérum Bovin NRB/P Nuclear Restricted Protein/Brain CCT8 Chaperonin Containing T complex

polypeptide 8 ORF Open Reading Frame

CYP2C8 Cytochrome P450, family 2, subfamily

C, polypeptide 8 p110^RB Retinoblastome Protein 110

DCC Deleted in Colorectal Cancer PAP-1 Pim-1-Associated Protein-1

DEPC Diethylpyrocarbonate pb paires de bases

DET1 De-Etiolated-1 PCR Polymerase Chain Reaction

DMRT5 Doublesex- and Mab-3-Related

Transcription factor 5 PLZF Promyelocytic Leukemia Zinc Finger

E(spl) Enhancer of Split PPA2c Phosphatase 2c

ECS Elongin Cullin SOCS PRC Polycomb Repressive Complex

EGF Epidermal Growth Factor RNAi RNA interference

eIF1 eukaryotic translation Initiation Factor 1 Robo Roundabout

eIF3 eukaryotic Initiation Factors 3 RPA RNAse Protection Assay Ell2 Ell-Related RNA Polymerase II,

Elongation Factor rpm Rotation par minutes

ERA Eléments de Réponse Antioxydants SCF Skp1-Cullin-F box

ESR Enhancer of Split Related shh Sonic Hedgehog

EST Expressed Sequence Tag SMRT Silencing Mediator of Retinoid and Thyroid hormon

FBLN1 Fibulin 1 SOCS Suppressor of Cytokyne Signaling

FBP1 Fuse Binding Protein-1 TCF T Cell Factor

FGF Fibroblast Growth Factor TGF-β Transforming Growth Factor- beta GSK3 Glycogen Synthase Kinase 3 TIA1 T Inducing Apoptosis-1

H2OmilliQ Eau purifiée par un système de type

MilliQ TLK Tousled-Like Kinase

HIC Hypermethylated In Cancer Ttk Tramtrack

HRT1 Hairy Related Transcription factor Ub Ubiquitine

kDa kiloDalton UTR UnTranslated Region

KTR14 Keratin 14 Wnt Wingless/Int-1

KTR4 Keratin 4 XBOIP Xenopus bc8 Orange Interacting Protein

LRRs Leucine-Rich Repeats X-Ngnr-1 Xenopus-Neurogenin-related-1 MAL2 Myelin And Lymphocyte 2 γFBP-B γF1 Binding Protein isoform B

Stade 6

Stade 1

Pôle animal

Oeuf

Stade 2 Stade 6

Stade 8

Stade 10

Blastula

Spermatozoïde

SEGMENTATION

Pôle végétal

Stade 10

Gastrula (section)

FECONDATION blastocoele

blastopore

GASTRULATION GASTRULATION

METAMORPHOSE

Stade 66

xénope adulte

Coté dorsal

future notochorde mesoderme

ectoderme endoderme

futur intestin

St d 12

NEURULATION ORGANOGENESE

Stade 45

têtard Coté ventral

Coté ventra l

Coté dorsal Partie

antérieure cerveau

chorde spinale notochorde

Partie antérieure bourrelets

neuraux

notochorde

Neurula

(surface effacée pour révéler la

notochorde)

Stade 12

l

Partie postérieur

e

bourgeon caudal Vue dorsale

(surface effacée)

Vue dorsale masse vitelline

Partie postérieur

e

Stade 15

Vue dorsale

Stade 13

Stade 26

Figure 1 : Représentation schématique du cycle de développement du xénope. A 23°c, la gastrulation se passe de 10 à 15 heures après la fécondation, la neurulation est terminée après 20 heures. Le bourgeon caudal est formée après un jour et le têtard après 4 jours. Il faut attendre 6 mois avant d’avoir des xénopes de taille adulte et environ 2 à 3 ans avant qu’ils atteignent leur maturité sexuelle (d’après Wolpert, L. 2002).

6 bis

INTRODUCTION

7

I. INTRODUCTION

La biologie du développement est une science qui cherche à étudier et comprendre les mécanismes biologiques permettant à une cellule unique d’évoluer pour générer un organisme adulte. La biologie moléculaire a permis, grâce à l’apparition de techniques expérimentales efficaces, d’accentuer l’orientation réductionniste qui est la base de la biologie depuis plusieurs décennies. Ainsi, aujourd’hui, les gènes peuvent être étudiés individuellement, ce qui permet aux biologistes de découvrir quels sont ceux qui contrôlent et guident les processus de développement d’un organisme.

Suivant le processus de développement étudié, le choix du modèle biologique est crucial. Ainsi dans le laboratoire d’embryologie moléculaire de l’Institut de Biologie et de Médecine Moléculaire (IBMM) de Gosselies (BELGIQUE), nous étudions les mécanismes moléculaires qui contrôlent les étapes précoces de la formation du système nerveux chez les vertébrés et pour cela nous utilisons comme modèle biologique le xénope, un petit amphibien particulièrement bien approprié pour ce type de recherche.

I.1. Le modèle xénope

Le xénope ou Xenopus laevis est aussi appelé grenouille africaine à pattes griffues (« clawed toad » en anglais). Originaire d’Afrique australe, c’est un amphibien de la classe des anoures et de la famille des pipidae qui peut être élevé dans l’eau du robinet. Son cycle de développement est bien connu (Figure 1). L’utilisation de cet animal présentent les avantages suivants : un élevage en laboratoire relativement aisé, la possibilité d’obtenir un grand nombre d’embryons dont la taille relativement importante (1 à 2 mm de diamètre) facilite leurs manipulations et permet l’observation macroscopique en continu des différentes étapes de l’embryogenèse, les embryons sont facilement maintenus en culture, enfin la fécondation se fait in vitro en ajoutant du sperme à des oeufs pondus par une femelle traitée à l’hormone gonadotrophine chorionique humaine (HCG). Plusieurs techniques expérimentales peuvent être utilisées grâce à ce modèle. La technique d’hybridation in situ sur embryons entiers permet de visualiser de façon spatiale et temporelle l’expression des gènes au cours du développement. L’étude fonctionnelle des gènes peut être abordée par d’une part l’observation des effets de la surexpression du produit d’un gène par la technique de micro- injection d’ARNm synthétique ; d’autre part par l’observation des effets de la perte de fonction d’un gène grâce aux techniques employant soit les morpholino-oligos antisens qui

Gastrula pigmentée

Gastrula non pigmentée

Partie antérieure

Coté ventra l

Coté dorsal

greffe

Partie postérieure Partie

antérieure

Coté ventra l

Coté dorsal

GASTRULATION

tube neural

Partie postérieure

blastopore blastopor

e secondair

e

NEURULATION

Partie antérieure chorde

somite mesoderme intermédiaire mesoderme intermédiaire

épiderme

endoderme

Partie postérieure Coté

ventra l

Coté dorsal

Neurula double

analyse

archentéron chorde tube neural somite

structure dorsale secondaire

ORGANOGENESE

Section transversale

histologique

Figure 2 : Représentation schématique de la célèbre expérience de Spemann et Mangold en 1924. La lèvre dorsale du blastopore d’un embryon pigmenté au stade gastrula est greffé sur la partie ventrale d’un autre embryon albinos au même stade.

L’embryon hôte développe un deuxième axe dorsal complet avec une polarité antéro- postérieure et dorso-ventrale correcte. La distribution des cellules pigmentées révèle la

Têtard double axe

contribution respective du greffon et de l’hôte (d’après Darribère, 2002).

7 bis

INTRODUCTION

8 en se fixant sur l’ARNm bloquent la traduction, soit par la technique de surexpression d’une forme mutante ayant un effet dominant négatif. Enfin, il existe des banques informatisées d’EST (Expressed Sequence Tag) de xénope permettant d’analyser in silico les séquences partielles ou entières de gènes.

I.2. Le développement embryonnaire du xénope I.2.1. Les premières étapes du développement

Lors de la fécondation, l’entrée du spermatozoïde induit un réarrangement cytoplasmique de la couche périphérique de l’œuf entraînant une rotation corticale de 30°

(Gerhart et al., 1989). Cette rotation déplace le matériel maternel du pôle végétal à l’opposé du point d’entrée du spermatozoïde ce qui déterminera l’axe dorso-ventral de l’embryon (Harland and Gerhart, 1997). L’œuf fécondé unicellulaire entre alors en division, c’est la segmentation. L’œuf devient une masse de cellules sans cavité interne, la morula, puis évolue pour devenir une blastula caractérisée par la présence du blastocoele. Les clivages continuent rapidement au sein de la blastula jusqu’au stade de la transition « mid-blastula » où les divisions ralentissent et où la transcription du génome s’initie (Newport and Kirschner, 1982). Quand la blastula se présente comme une sphère creuse, des mouvements cellulaires importants s’amorcent, c’est la gastrulation. Dans la partie dorso-postérieur de la blastula apparaît le blastopore, zone où les cellules de la zone marginale migrent à l’intérieur de l’embryon. Les cellules convergent et s’allongent en définissant un axe antéro-postérieur permettant l’organisation des trois feuillets primordiaux, l’ectoderme, le mésoderme et l’endoderme. C’est l’ectoderme qui donnera l’épiderme, les muscles lisses et striés de la tête et du cou, une partie du squelette cartilagineux de la tête, les glandes médullo-surrénales, les placodes, le système nerveux périphérique et le système nerveux central (Gerhart et al., 1989).

I.2.2. L’induction neurale chez le xénope

Le stade suivant de développement est appelé la neurulation. L’ectoderme dorsal s’épaissit définissant le territoire de la plaque neurale qui va devenir le tissu neural, le neuroectoderme. Le concept d’induction neurale a été défini par une expérience de transplantation devenue célèbre en embryologie effectuée par Spemann et Mangold en 1924 (Figure 2). L’expérience consiste à greffer un morceau de tissu provenant de la lèvre dorsale

INTRODUCTION

9 du blastopore d’un embryon pigmenté au stade gastrula sur la partie ventrale d’un autre embryon albinos au stade gastrula. Le résultat obtenu montre que l’embryon hôte développe un axe secondaire où le système nerveux central provient de l’ectoderme de l’hôte car non pigmenté tandis que le mésoderme provient de la greffe car pigmenté (Spemann and Mangold, 1924). Cette expérience montre que la lèvre dorsale du blastopore induit la transformation de l’ectoderme proche en tissu neural. Cette partie de l’embryon a été désignée centre organisateur ou organisateur de Spemann (Spemann and Mangold, 1924).

Des territoires ayant les mêmes propriétés organisatrices ont été mises en évidence chez d’autres espèces, appelées bouclier chez le poisson zèbre (Shih and Fraser, 1996), ou nœud de Hensen chez la souris (Beddington, 1994) et le poulet (Storey et al., 1992).

I.2.3. Les bases moléculaires de l’induction neurale chez le xénope

Après la mise en évidence des capacités inductrices de l’organisateur de Spemann, la recherche des bases moléculaires qui permettent cette induction a été intensivement menée.

Le premier gène découvert ayant un rôle important dans l’induction neurale code pour la protéine sécrétée BMP4 (Bone Morphogenetic Protein 4) appartenant à la super famille des protéines de type TGF-β (Transforming Growth Factor-β). Il a été observé que ce gène était exprimé dans l’ectoderme de l’embryon au stade gastrula précoce et que son expression dans la partie dorsale disparaît pendant la gastrulation au moment de l’apparition de l’organisateur de Spemann (Fainsod et al., 1994). De plus la perte de fonction de BMP4 par micro-injection d’ARNm codant pour une forme mutante de BMP4 (Xu et al., 1995) entraîne l’induction neurale. Ces données indiquent que l’inactivation de BMP4 est associée avec l’induction neurale. De manière concomitance, il a été montré que l’organisateur de Spemann sécrète une série d’antagonistes des BMPs favorisant l’induction neurale tels que noggin (Smith and Harland, 1992), follistatin (Hemmati-Brivanlou and Melton, 1994), chordin (Sasai et al., 1994), cereberus (Bouwmeester et al., 1996) gremlin, dan et drm (Hsu et al., 1998), ogon/sizzled (Yabe et al., 2003). Ces découvertes permettent d’expliquer les résultats obtenus dans les expériences suivantes. Lorsque les cellules d’une calotte animale de gastrula sont dissociées pendant quelques heures, ceci afin d’abolir les communications paracrines, puis ensuite réagrégées, le tissu évolue vers une destinée neurale. Si la calotte animale n’est pas dissociée ou si les cellules sont réagrégées immédiatement, le tissu devient de l’épiderme (Grunz and Tacke, 1989). Complémentairement, la même expérience de dissociation de quelques heures d’une calotte animale de gastrula d’embryon préalablement micro-injecté

blastula

Pôle animal Pôle animal

Côté dorsal

Côté ventral

chordin CHORDIN zygotique

maternel

Pôle végétatif

β-catenine bmp

noggin NOGGIN

BMP/Smad1

fgf FGF

Veg-T

Xnrs XNRs

haut

Endoderme

Figure 3 : Représentation schématique du modèle de l’induction neurale chez le xénope. Au stade blastula les tissus présomptifs de l’épiderme (en bleu), du neuroectoderme (en vert) et du mésoderme (en rouge) sont positionnés par l’activité de signaux maternels. Le facteur de transcription Veg-T (points violets) présent dans le pôle végétatif induit la formation de l’endoderme et du mésoderme. Le facteur β-catenine (points oranges) est présent dans la partie dorsale de l’embryon et induit la dorsalisation

Xnrs XNRs

(points oranges) est présent dans la partie dorsale de l embryon et induit la dorsalisation du mésoderme et de l’ectoderme. L’action conjuguée de ces facteurs induit la formation de l’organisateur de Spemann. A la transition midblastula, l’activitée transcriptionelle du zygote permet l’expression des facteurs nodal-related (Xnrs). Ces facteurs induisent la transformation des tissus en endoderme et jouent un rôle dans l’induction du mésoderme en même temps que FGF qui est le principal inducteur mésodermique. Les BMPs dans l’ectoderme induisent la formation de l’épiderme. Les données actuelles permettent de dire que le neuroectoderme apparaît grâce à l’action des antagonistes des BMPs (Noggin, Chordin) provenant de l’organisateur de Spemann et dont l’expression est induite par) p g p p p l’activité de la β-catenine (dont on sait que son activité est régulée par la voie Wnt).

Intervient aussi l’action du FGF qui bloquent, en association avec les antagonistes des BMPs mais aussi directement, la voie de signalisation des BMPs. Ce modèle récent du mécanisme de l’induction neurale chez le xénope remplace le modèle plus simpliste de l’induction dite par défaut. (d’après Delaune et al., 2004).

9 bis

INTRODUCTION

10 avec de l’ARNm codant pour les effecteurs de la voie de signalisation de BMP4 comme Smad1 ou Smad5 montre que le tissu ne se neuralise pas (Wilson et al., 1997 ; Suzuki et al., 1997). L’ensemble de ces résultats a donné naissance au modèle de l’induction neurale « par défaut », où les cellules de l’ectoderme d’une gastrula ont une tendance autonome à générer du tissus neural, cette tendance est contrecarrée par l’activité des BMPs mais restaurée spécifiquement dans le territoire de la plaque neurale par les antagonistes des BMPs sécrétés par l’organisateur de Spemann (Hemmati-Brivanlou and Melton, 1997). Cependant les résultats obtenus chez le poulet montrent que les antagonistes des BMPs ne permettent pas l’induction du tissu neural dans l’épiblaste de poulet (Streit and Stern, 1999). De même chez la souris la différentiation neurale a lieu en absence de noggin ou de follistatin (McMahon et al.1998 ; Matzuk et al., 1995). Ces données suggèrent que des mécanismes supplémentaires participent de manière complémentaire ou indépendante à l’induction neurale. Des travaux récents ont mis en évidence que le facteur de croissance FGF (Fibroblast Growth Factor) est une molécule impliquée dans l’induction neurale. En effet, il a été montré chez le xénope que la micro-injection des ARNm codant pour un mutant dominant négatif de FGF avec ceux de chordin (Pera et al., 2003) ou de noggin (Launay et al., 1996) n’induit pas la neuralisation de calottes animales isolées. Complémentairement, la micro-injection de l’ARNm codant pour la protéine Smad6, un antagoniste de la voie de signalisation des BMPs, dans un blastomère ventral sans destiné neurale n’induit pas la neuralisation des cellules dérivant de ce blastomère sauf si l’on micro-injecte simultanément l’ARNm codant pour FGF4 (Linker and Stern, 2004). Ces données indiquent que les protéines de la famille FGF jouent un rôle coopératif avec les antagonistes des BMPs au cours de l’induction neurale. Il a été montré que la voie de signalisation FGF permet l’activation de MAPK qui phosphorylent un effecteur de la voie de transduction des BMPs, la protéine Smad1, entraînant son inhibition. Il a aussi été montré que la voie de signalisation FGF est impliquée dans l’induction neurale indépendamment de sa capacité inhibitrice de la voie de signalisation des BMPs (Aubin et al., 2004 ; Delaune et al., 2005). De nouveaux travaux ont montré de plus que la voie de signalisation Wnt est aussi impliquée dans l’induction neurale. Les protéines de type Wnt sont des protéines sécrétées qui reconnaissent le récepteur transmembranaire Frizzled, l’activation de ce récepteur permet l’activation de la protéine cytoplasmique dishevelled qui elle-même inhibe la GSK3 (glycogen synthase kinase 3). La GSK3 ne peut donc plus phosphoryler la protéine β-catenine, phosphorylation qui entraîne sa dégradation. La protéine β-catenine va alors pouvoir interagir avec la protéine TCF, une protéine de liaison à l’ADN, permettant ainsi l’expression de gènes impliqués dans le processus de neuralisation de

Action des gènes proneuraux XNgnr-1, XNeuroD, Xath3

Action des gènes neurogeniques XNotch, XDelta

Induction neurale Xchordin, Xnoggin, XFGF, XWnt

Figure 4 : Représentation schématique de la neurogenèse primaire dans la plaque neurale chez le xénope.L’induction neurale définie le territoire où la neurogenèse à lieu, la plaque neurale.

Au sein de la plaque neurale, l’action des gènes proneuraux définissent les régions cellulaires où vont naître les futurs neurones primaires, les domaines proneuraux. Les gènes neurogéniques vont

Plaque neurale Domaines proneuraux Précurseurs neuronaux

Repliement de la plaque neurale Formation du tube neural Plaque neurale

g g

permettre la sélection spécifique des cellules destinées à se différencier en neurones primaires et empêcher les autres cellules de devenir des neurones, c’est l’inhibition latérale.

Figure 5 : Représentation schématique de la formation du tube neural. Au sein de la plaque neurale ouverte se définissent trois domaines proneuraux où naissent les trois types de neurones

Neurones moteurs Neurones intermédiaires Neurones sensoriels

p yp

primaires, les neurones moteurs (en rouge), les neurones intermédiaires (en vert), les neurones sensoriels (en bleu). Au cours de la neurulation, la plaque neurales converge en son axe médian pour former, après fermeture, le tube neural.

Zone marginale Lumière du tube neural

é é

Somite Notocorde

Zone ventriculaire Zone subventriculaire

Figure 6 : Représentation schématique d’une section du tube neural.Trois couches cellulaires sont à distinguer. La zone ventriculaire où les cellules précurseurs de neurones sont en division active, la zone subventriculaire où les premiers neurones postmitotiques apparaissent et la zone marginale où les neurones sont en différentiation.

10 bis

INTRODUCTION

11 l’ectoderme ( Hansen et al., 1997 ; Carnac et al., 1996). Il a été montré que l’expression de Wnt8 murin, Wnt8 chez le xénope, ou d’un dominant négatif de GSK3, ou encore de β- catenine induit l’induction neurale et inhibe l’expression de BMP4 (Baker et al., 1999). En conclusion, un nouveau modèle plus complet intégrant les données concernant les voies de signalisation de FGF et Wnt synthétisant les mécanismes sous-jacents de l’induction neural chez le xénope 42

a été proposé par Delaune (Figure 3). Ce modèle remplace le modèle plus simpliste de l’induction dite par défaut.

I.2.4. La neurogenèse primaire

L’élaboration du système nerveux chez les vertébrés est un processus qui se déroule relativement tôt pendant le développement. La sélection, la différentiation et l’organisation des différentes populations de cellules qui constitueront le système nerveux sont des évènements qui nécessitent des mécanismes complexes d’interactions entre différents facteurs biologiques. La neurogenèse chez le xénope peut être divisée en deux phases. La première phase est la neurogenèse primaire qui voit l’apparition des premiers neurones, les neurones primaires, qui contrôlent les premiers mouvements de l’embryon. La seconde phase s’initie approximativement vers le stade 46 du développement et consiste dans la génération des neurones secondaires qui contribueront à la formation du système nerveux du têtard en croissance puis de l’adulte et qui remplaceront en grande majorité les neurones primaires (Schlosser et al., 2002). La neurogenèse chez le xénope, ainsi que chez presque tous les vertébrés, débute dans la région postérieure de la plaque neurale où des signaux comme shh (Sonic Hedgehog) (Franco et al., 1999), l’acide rétinoïque (RA) (Sharpe and Goldstone, 2000), les protéines de type Gli (Nguyen et al., 2005) jouent un rôle important dans la définition des régions neurogéniques. Les neurones primaires en différentiation apparaissent dans la partie postérieure de la plaque neurale en s’organisant en trois bandes longitudinales et symétriques de part et d’autre de la ligne dorsale médiane de la plaque neurale. Ces trois bandes de neurones représentent trois populations de neurones primaires, les plus latéraux sont les neurones sensoriels, puis ce sont les neurones intermédiaires et les plus centraux sont les neurones moteurs (Figure 4) (Chitnis et al., 1995). Chez le xénope, le neuroectoderme est constitué par deux couches cellulaires constituant l’épithélium superficiel en surface et l’épithélium sensoriel en profondeur. Les précurseurs des neurones primaires se trouvent dans l’épithélium sensoriel alors que les précurseurs des neurones secondaires sont présents

Activation de la Activation de la voie de signalisation Notch/ICD

XNgnr1

XDelta

XN t h ICD

Activation de la

cascade proneurale signalisation Notch/ICD (Inhibition latérale)

E( l)R XNKL

XMYT1 Xash3

XATH3 Xebf2/XCoe2

XNotch ICD

XNgnr1 E(spl)R

Xebf3 XNeuroD

NEURONES CELLULES GLIALES

Figure 7 : Représentation schématique de la cascade d’activation proneurale sous le contrôle de l’inhibition latérale.Le gèneXNgnr-1est le premier gène exprimé dans les cellules progénitrices neurales qui sont destinés à devenir des neurones. Il induit l’expression en cascade de gènes codant pour des protéines de types bHLH ou non bHLH qui permettront la différentiation neuronale. L’induction de l’expression du gène XDeltapar le gène XNgnr-1va activer la voie de signalisation Notch/ICD et entraîner le blocage de la cascade proneurale dans les cellules proches. Ces cellules deviendront des cellules gliales ou donneront naissance à d’autres neurones plus tard au cours dug p développement.

11 bis

INTRODUCTION

12 dans les deux épithéliums. Pendant le neurulation, les deux couches cellulaires se mélangent et l’épithélium qui en résulte donnera le tube neural. Au sein du tube neural, les neurones sont organisés en couches cellulaires distinctes, la zone ventriculaire est constituée des précurseurs neuraux qui se divisent activement, la zone subventriculaire contient les premiers neurones post-mitotiques et la zone marginale correspond à la zone où les neurones vont se différencier (Figure 5 et 6).

I.2.5. Le contrôle de la neurogenèse primaire chez le xénope

I.2.5.1. La cascade d’activation des gènes proneuraux

Les cellules pluripotentes présentes dans le neuroectoderme sont sélectionnées et se différencient en neurones grâce à l’activation d’une cascade de gènes appelés gènes proneuraux. Les premiers gènes proneuraux ont été mis en évidence chez la drosophile, ce sont les gènes codant pour des facteurs de transcription de type bHLH (basic Helix Loop Helix) comme les groupes des gènes achete-scute et atonal-related. Chez les vertébrés l’expression de ces gènes déclenchent la différentiation des cellules progénitrices neurales en neurones.(Campos-Ortega, 1998). Chez le xénope, les homologues des gènes achete-scute connus sont les gènes Xash1 et Xash3. Des expériences d’hybridation in situ ont montré que le gène Xash1 est exprimé dans les tissus nerveux en développement (Ferreiro et al., 1993) et que le gène Xash3 est exprimé au sein de la plaque neurale durant la neurogenèse. De plus la surexpression du gène Xash3 par micro-injection d’ARNm induit la différenciation neuronale (Ferreiro et al., 1994). Les homologues des gènes atonal-related de xénope sont les gènes Xath1, Xath3, Xath5, XNeuroD et XNgnr-1 (Xenopus Neurogenin related-1). Des expériences d’hybridation in situ ont montré que ces gènes sont exprimés dans le système nerveux en développement (Kim et al., 1997; Takebayashi et al., 1997; Kanekar et al., 1997;

Lee et al., 1995; Ma et al., 1998). Ces gènes codant pour des protéines de type bHLH fonctionnent dans une cascade d’activation mettant en jeu des boucles de rétrocontrôle ainsi que l’action de gènes codant pour d’autres types de facteurs comme les protéines de type HLH (Helix Loop Helix) Xebf2 (Dubois et al., 1998) et Xebf3 (Pozzoli et al., 2001) ou comme les protéines à doigts à zinc XMyt1 (Bellefroid et al., 1996) et XNKL (Lamar et al., 2001) (Figure 7). Des expériences de surexpression par micro-injection d’ARNm de XNgnr- 1 suivit par une analyse par hybridation in situ montrent que XNgnr-1 induit l’apparition de neurones ectopiques. Le même type d’expérience montre que XNgnr-1 induit l’expression des gènes XNeuroD et de Xath3. De plus XNeuroD et Xath3 induisent réciproquement leur

XDe

XICD elta

E(spl)R Co-act.

Notch/ICD

XNotch-1

XSu(H)

E(spl)R

XNgnr1

XSu(H)

E(spl)R Co-rep.

Noyau Cytoplasme

ADN

Notch/ICD

Figure 8 : Représentation schématique de la voie de signalisation XNotch-1. La liaison du ligand XDelta au récepteur XNotch-1 entraîne le clivage enzymatique de la partie intra-cytoplasmique Notch/ICD. En absence de Notch/ICD, le facteur de transcription XSu(H) est associé à un complexe répresseur (Co-rep.) qui bloque l’expression des gènes E(spl)R ; en présence de Notch/ICD, le complexe répresseur est déplacé puis remplacé par un complexe activateur (Co-act.) qui induit l’expression des gènes E(spl)R bloquant l’expression du premier gène important de la cascade proneurale,XNgnr-1.

Noyau Cytoplasme

précurseurs neuronaux inhibition latérale différentiation cellulaire

Figure 9 : Représentation schématique du mécanisme d’inhibition latérale.Au sein d’un groupe de précurseurs neuronaux non différenciés, une cellules entre dans le processus de différenciation neuronale. L’expression des gènes proneuraux est activée et le mécanisme d’inhibition latérale médiée par la voie de signalisation Notch est déclenché.

’ é ’é ’ ffé é

précurseurs neuronaux indifférenciés

inhibition latérale différentiation cellulaire neurones (rouge) et cellules gliales (vert)

L’inhibition latérale permet d’établir autour d’un neurone différencié un ensemble de cellules maintenues à l’état indifférencié.

12 bis

INTRODUCTION

13 expression (Perron et al., 1999). L’accomplissement de cette cascade d’activation des gènes proneuraux mène à la différentiation des précurseurs neuronaux en neurones, alors que dans d’autres cellules cette voie est inhibée par un processus biologique appelé l’inhibition latérale.

I.2.5.2. L’inhibition latérale

Le mécanisme d’inhibition latérale est initié par l’activation des gènes proneuraux dans les précurseurs neuraux destinés à se différencier en neurones. La protéine XNgnr-1 induit l’expression du gène XDelta-1 (Chitnis and Kintner, 1996) codant pour une protéine transmembranaire possédant des répétitions de domaines de type EGF (Epidermal Growth Factor) (Rebay et al., 1991). Les interactions cellulaires permettent, au ligand XDelta-1, la reconnaissance sur la surface membranaire de la cellule voisine du récepteur XNotch-1 (Coffman et al., 1990). L’interaction du ligand et du récepteur entraîne le clivage du domaine intracellulaire de XNotch-1 (Notch/ICD) (DeStrooper et al., 1999). Le peptide Notch/ICD est ensuite transloqué dans le noyau où il interagit avec des facteurs de transcription à doigts à zinc. Chez le xénope, Notch/ICD interagit avec le facteur XSu(H) (Suppressor of Hairless) (Wettstein et al., 1997). En absence du peptide Notch/ICD, le facteur XSu(H) est associé à un complexe répresseur transcriptionnel (Kao et al., 1998). L’interaction entre Notch/ICD et XSu(H) déplace le complexe transcriptionnel et permet le recrutement de facteurs qui initient l’expression des gènes de la famille E(spl) (Enhancer of Split). Chez le xénope il s’agit des gènes de la famille E(spl)R (Enhancer of Split Related) (Wettstein et al., 1997). Ces gènes inhibent la transcription du gène XNgnr-1 bloquant ainsi la cascade d’activation des gènes proneuraux dans la cellule, lui interdisant ainsi la différenciation neuronale (Figure 8 et 9).

Des expériences de surexpression par micro-injection d’ARNm suivit par l’analyse par hybridation in situ des embryons injectés montrent que l’injection d’une forme mutante correspondante au domaine intracellulaire du récepteur XNotch-1 (Notch/ICD), permettant de mimer l’activation constitutive du récepteur XNotch-1, bloque de manière drastique la neurogenèse (Wettstein et al., 1997). Inversement, l’injection d’un peptide correspondant à une forme tronquée de XDelta-1 (XDelta-1^stu) agissant comme mutant dominant négatif augmente le nombre de neurones dans les domaines proneuraux (Chitnis et al, 1995). Au cours de la neurogenèse, le mécanisme d’inhibition latérale permet de réguler la destinée cellulaire des précurseurs neuraux.

Figure 10 : Diagramme Ribbon de la molécule d’ubiquitine. Le programme informatique Ribbon 3.0^© (UAB Center for Macromolecular Crystallography) permet de représenter la molécule d’ubiquitine en 3 dimensions et de mettre en exergue les sites fonctionnellement importants. Les 7 résidus lysines sont colorés en rouge et les poches hydrophobes qui jouent un rôle dans les interactions interprotéiques de l’ubiquitine sont colorées en jaune (Pickart, C., 2004).

ATP + Ub -C-OH=O AMP + PPi

E1 E1

ATP + Ub -C-OH AMP + PPi

-Cys-SH -Cys-S-C-=O Ub

E2 E2

E3

-Cys-SH -Cys-S-C-=O O Ub

Substrat

Substrat

O

H-

Figure 11 : Représentation schématique de la cascade d’ubiquitination d’un substrat.Une molécule d’ubiquitine est liée de manière covalente à une protéine substrat par un mécanisme mettant en jeu trois enzymes Une enzyme d’activation de l’ubiquitine

Substrat

Ub Ub

Ub Ub

Ub Ub

Ub

Protéasome 26S

par un mécanisme mettant en jeu trois enzymes. Une enzyme d’activation de l’ubiquitine E1, une enzyme de conjugaison de l’ubiquitine E2 et une enzyme de ligation de l’ubiquitine E3. L’action successive de cet ensemble d’enzymes permettra la génération d’une chaîne de plusieurs ubiquitines liée à la protéine substrat, ce qui entraînera sa dégradation par le protéasome 26S (d’après Passmore L. et Barford, D., 2004).

13 bis

INTRODUCTION

14 I.3. Un système de régulation des mécanismes biologiques :

l’ubiquitination.

I.3.1. L’ubiquitination

L’ubiquitination des protéines est considérée comme un mécanisme biologique régulateur comparable à celui de la phosphorylation (Pickart and Fushman, 2004). Le peptide d’ubiquitine (Ub) est constitué par 76 résidus d’acides aminés pour un poids moléculaire de 8 kDa. C’est une protéine qui a été extrêmement bien conservée au cours de l’évolution puisqu’il n’y a que 3 résidus d’acides aminés sur 76 qui différent entre la protéine humaine et celle de la levure. Les gènes codants pour l’ubiquitine sont présents en plusieurs copies dans le génome et leur traduction génère des chaînes de polypeptides d’ubiquitines fusionnés par leur extrémité C-terminale. Ce sont des enzymes de déubiquitination qui clivent les polymères et génèrent des monomères d’ubiquitines (Dworkin-Rastl et al., 1984; Ozkaynak et al., 1984). La liaison de l’ubiquitine au substrat protéique se fait en plusieurs étapes successives nécessitant de l’énergie et utilisant des enzymes spécifiques (Hershko et al., 1983). Le groupe carboxyl de la glycine, positionné à l’extrémité C-terminale de l’ubiquitine, est lié de manière covalente à un résidu lysine du substrat par une liaison isopeptidique. Un nouveau peptide d’ubiquitine peut se lier à l’ubiquitine précédemment associée au substrat générant ainsi une chaîne de polyubiquitine. L’ubiquitine possède 7 résidus lysines (K6, K11, K27, K29, K33, K48 et K63) et tous peuvent se lier à une autre ubiquitine (Peng et al., 2003) (Figure 10). La fixation d’une ubiquitine (une monoubiquitination) ou d’une chaîne d’ubiquitines (une polyubiquitination) entraîne différentes fonctions régulatrices (Hicke, 2001 ; Pickart, 2000). La liaison d’une chaîne de polyubiquitine, d’au moins quatre ubiquitines, sur le résidu lysine 48 (K48) permet d’orienter le substrat vers le système de dégradation protéolytique du protéasome 26S (Thrower et al., 2000). La liaison d’une unique molécule d’ubiquitine ou d’une chaîne polyubiquitine via les résidus lysines 6 (K6) et 63 (K63) n’entraîne pas la dégradation du substrat par le protéasome 26S mais altère son activité en modifiant sa localisation (Pickart and Fushman, 2004) ou ses propriétés d’interactions protéiques (Sigismund et al., 2004). La combinaison de ces types d’ubiquitination donne à la cellule un moyen important de contrôle des différents processus biologiques. Les mécanismes qui mènent à l’ubiquitination d’un substrat ont été intensément étudiés et cela a permis d’élaborer un modèle pour la cascade d’ubiquitination.

Structure générique Le type APC/C

Complexe E3 E2

Substrat E1

protéine daptatrice

Ub Ub Ub

UbUb UbUb

Apc2

? Apc11Ubc

C box

Substrat E1

Ub Ub Ub

UbUb UbUb WD40

A B

Substrat

p ad

Le type SCF Le type ECS

protéasome 26S

Substrat

protéasome 26S

Pds1 Clb2 Clb1 Cdc20

Cdh1 Ama1p

Ub Ub

cullin1 E1

Skp1 Hrt1

F box

Substrat

Uba1

Ub Ub

UbUb UbUb

cdc34

cullin2

Elongine B Hrt1

SOCS

Substrat

Ub Ub

UbUb UbUb VHL

WD40 Ank

Elongine C E2

LRR WD40

C D

E1

Le type BTB-cullin3 Le type Ddb-cullin4

protéasome 26S

Sic1

Cdc4 ^{Neuralized Delta} protéasome 26S

cullin4

Ub

cullin3 E1

Ub

E

F

? Hrt1

?

Substrat

Ub

protéasome 26S

Ub

UbUb UbUb

?

Jun DET1

E2

E1

Hrt1

BTB

Substrat

Ub

protéasome 26S

Ub

UbUb UbUb

MEI1 Nrf2 M H2A/BMI1 MEL26

Keap1 S

E2

MATH Kelch

Figure 12 : Représentation des différents types de complexes contenant les protéines ubiquitine ligase E3 à domaine de type RING.

MacroH2A/BMI1 Spop

14 bis

INTRODUCTION

15 I.3.2. La cascade d’ubiquitination

L’ubiquitination des protéines est un processus complexe qui met en jeu une succession d’enzymes spécifiques. Il y trois types d’enzymes, les enzymes d’activation E1, les enzymes de conjugaison E2 et les enzymes de ligation E3. L’ubiquitine est liée à un résidu cystéine de l’enzyme E1 par une liaison thiolesther, cette association permet l’activation de la molécule d’ubiquitine. Le transfert de l’ubiquitine de l’enzyme E1 à l’enzyme E2 se fait aussi par la formation d’une liaison thiolesther entre l’ubiquitine et un résidu cystéine de l’enzyme E2. L’enzyme E2 se lie de façon temporaire à l’ubiquitine permettant le transfert de la molécule d’ubiquitine sur le substrat. L’enzyme E3 permet le rapprochement spatial de l’enzyme E2 avec son substrat (Passmore and Barford, 2004) (Figure 11). Il n’y a que deux types d’enzymes E1, les enzymes E2 sont les plus représentées mais leur nombre est limité (environ 40) par contre il y a de très nombreuses formes d’enzymes de type E3 (plus de 1000). Il est possible néanmoins de diviser la famille des protéines de type ubiquitine ligase E3 en deux sous familles en fonction de motifs protéiques caractéristiques, d’une part les protéines E3 à domaine HECT qui combinent les activités E2 et E3 et d’autre part les protéines E3 à domaine RING qui permettent l’ubiquitination en positionnant la protéine E2 à proximité du substrat. C’est cette dernière sous famille qui nous intéressera le plus pour cette étude.

I.3.3. Les protéines ubiquitine ligases E3 à domaine de type RING

Deux principaux types de protéines ubiquitine ligase E3 sont aujourd’hui identifiés et caractérisés au sein de leur complexe fonctionnel qui présentent entre eux de fortes similarités (Figure 12-A). Le complexe protéique de type APC/C (Anaphase Promoting Complex/Cyclosome) (Figure 12-B) et le type de complexe SCF (Skp1-Cullin-F box) (Figure 12-C). Le complexe APC/C d’ubiquitination a été découvert en étudiant le cycle cellulaire. Il a été montré que ce complexe permet le contrôle de l’anaphase en initiant l’ubiquitination et la dégradation de la sécurine, une protéine qui contrôle la séparation des chromosomes pendant l’anaphase. De plus ce complexe est un élément de régulation de la mitose cellulaire car il initie la dégradation de membres de la famille des régulateurs du cycle cellulaire de type cycline, les cyclines B1 et B2 (Sudakin et al.1995 ; King et al., 1995). Les travaux qui ont suivit ont caractérisé les différents composants du complexe d’ubiquitination APC/C. C’est l’association des protéines Apc2 et Apc11 qui donne la fonction enzymatique d’ubiquitination mais sans spécificité (Tang et al., 2001). L’association spécifique du substrat