Colocalisation de XBTBD6 avec HBTBD1 et HBTBD2

Nous avons cherché à déterminer si les corpuscules où est localisée XBTBD6 peuvent être les mêmes que ceux où sont localisées les protéines humaines HBTBD1 et HBTBD2.

Pour cela nous avons utilisé la construction XBTBD6-GFP et les constructions pCMV-HBTBD1-DsRed (HBTBD1-DsRed) et pCMV-HBTBD2-GFP (HBTBD2-GFP) aimablement fournies par le laboratoire du Docteur P. D’Arpa. Nous avons cotransfecté de façon transitoire en cellules COS7 d’une part les constructions HBTBD1-DsRed et HBTBD2-GFP et d’autre part les constructions XBTBD6-GFP et HBTBD1-DsRed. Nous avons ensuite fixé les cellules et observé la fluorescence sous microscope.

Les résultats montrent comme cela a déjà été décrit dans les cellules Hela, que HBTBD1-DsRed et HBTBD2-GFP colocalisent dans le cytoplasme des cellules COS7 au

HOECHST HBTBD2-GFP COS7

M

HOECHST HBTBD2-GFP COS7

A

M

A

HBTBD1-dsRed FUSION HBTBD1-dsRed FUSION XBTBD6 -GFP HOECHST

N

XBTBD6 -GFP HOECHST

B

HBTBD1-dsRed FUSION HBTBD1-dsRed FUSION

Figure 23 : Comparaison des localisations subcellulaires des protéines XBTBD6, HBTBD1 et HBTBD2 en cellules COS7. Les cellules COS7 ont été transfectées avec les différentes constructions puis cultivées deux jours. Les cellules sont traitées puis placées sur lame pour l’observation microscopiquep p p p q directe de la GFP. Les résultats montrent (A) d’une part que HBTBD1-DsRed et HBTBD2-GFP colocalisent dans le cytoplasme des cellules COS7 au sein de corpuscules cytoplasmiques et (B) d’autre part que HBTBD1-DsRed et XBTBD6-GFP colocalisent dans le cytoplasme des cellules au sein de ces corpuscules cytoplasmiques.

XBTBD6-GFP HOECHST FUSION

Hela

O

XBTBD6-GFP HOECHST FUSION

Hela

A

O

A

FLAG-XBTBD6 HOECHST FUSION

P

FLAG-XBTBD6 HOECHST FUSION FLAG-XBTBD6 HOECHST FUSION

B

FLAG-XBTBD6-Nterm HOECHST FUSION

Q

FLAG-XBTBD6-Nterm HOECHST FUSION FLAG-XBTBD6-Nterm HOECHST FUSION

C

FLAG-XBTBD6-Cterm HOECHST FUSION FLAG-XBTBD6-Cterm HOECHST FUSION FLAG-XBTBD6-Cterm HOECHST FUSION

R

D

Figure 24 : Localisation subcellulaire de la protéine XBTBD6 et de ses mutants XBTBD6 Nterm et XBTBD6 Cterm en cellules Hela. Les cellules Hela ont été transfectées avec les différentes constructions puis cultivées deux jours. Les cellules sont traitées suivant le type de construction transfecté (soit pour le marquage immunocytochimique soit pour l’observation directe de la GFP) puis placées pour l’observation microscopique. (A et B) Les résultats montrent que la protéine XBTBD6 aussi bien en fusion avec la GFP qu’avec un épitope FLAG est protéine XBTBD6 aussi bien en fusion avec la GFP qu avec un épitope FLAG est localisée dans le cytoplasme dans des corpuscules cytoplasmiques. (C) Le mutant correspondant à la partie N-terminale de la protéine XBTBD6 est localisé comme la protéine entière dans des corpuscules cytoplasmiques. (D) Le mutant correspondant à la partie C-terminale est localisé uniquement dans le noyau. Ces résultats présentent des similarités avec ceux obtenus en cellules COS7.

XBTBD6-GFP HOECHST FUSION

U2OS

R

XBTBD6-GFP HOECHST FUSION

U2OS

A

R

A

FLAG-XBTBD6 _{HOECHST FUSION}

T

FLAG-XBTBD6 _{HOECHST FUSION}

B

FLAG-XBTBD6-Nterm _{HOECHST FUSION}

U

FLAG-XBTBD6-Nterm _{HOECHST FUSION}

C

FLAG-XBTBD6-Cterm _{HOECHST FUSION} FLAG-XBTBD6-Cterm _{HOECHST FUSION}

V

D

Figure 25 : Localisation subcellulaire de la protéine XBTBD6 et de ses mutants XBTBD6 Nterm et XBTBD6 Cterm en cellules U2OS. Les cellules U2OS ont été transfecté avec les différentes constructions puis cultivées deux jours. Les cellules sont traitées suivant le type de construction transfecté (soit pour le marquage immunocytochimique soit pour l’observation directe de la GFP) puis placées pour l’observation microscopique. (A et B) Les résultats montrent que la protéine XBTBD6 aussi bien en fusion avec la GFP qu’avec un épitope FLAG est localisée dans le cytoplasme dans des corpuscules cytoplasmiques. (C) Le mutant de délétion correspondant à la partie N-terminale de la protéine XBTBD6 est localisé comme la protéine entière dans des corpuscules cytoplasmiques. (D) Le mutant de délétion correspondant à la partie C-terminale est localisé uniquement dans le noyau. Ces résultats présentent des similarités avec ceux obtenus en cellules COS7 et en cellules Hela.

RESULTATS

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sein de corpuscules cytoplasmiques (Figure 23-A). De plus HBTBD1-DsRed et

XBTBD6-GFP colocalisent parfaitement dans le cytoplasme des cellules au sein de ces corpuscules cytoplasmiques (Figure 23-B).

Ainsi nous pouvons conclure que HBTBD1-DsRed, HBTBD2-GFP et XBTBD6-GFP colocalisent dans les mêmes corpuscules cytoplasmiques.

III.1.4.1. Le domaine BTB-POZ est requis pour la localisation de XBTBD6 dans

les corpuscules cytoplasmiques

Ayant montré que la protéine XBTBD6-GFP est localisée dans des corpuscules cytoplasmiques, nous avons voulu déterminer le rôle que jouent les différentes parties de la protéine dans sa localisation cellulaire.

Pour cela nous avons cloné dans le vecteur d’expression PCS2(+) contenant en 5’ du site de clonage la séquence codant pour l’épitope FLAG, des mutants de délétion de XBTBD6 contenant la séquence codant pour la moitié N-terminale contenant le domaine BTB-POZ (FLAG-XBTBD6-Nterm) ou la moitié C-terminale sans le domaine BTB-POZ (FLAG-XBTBD6-Cterm). Nous avons transfecté de façon transitoire les constructions dans les cellules COS7, Hela et U2OS. Nous avons ensuite effectué des expériences d’immunocytochimie en utilisant un anticorps secondaire couplé à la FITC puis fixé les cellules pour une observation de la fluorescence sous microscope. Les résultats montrent d’une part que dans les trois types cellulaires utilisés le mutant de délétion codant pour la partie N-terminale contenant le domaine BTB-POZ de la protéine XBTBD6 est localisé dans le cytoplasme au sein des corpuscules cytoplasmiques (Figure 19-C, Figure 24-C et Figure

25-C). D’autre part, nous observons que dans les trois types cellulaires utilisés le mutant de

délétion codant pour la partie C-terminale de la protéine XBTBD6 est localisé exclusivement dans le noyau de la cellule (Figure 19-D, Figure 24-D et Figure 25-D). Nous n’avons pas pu obtenir de résultat satisfaisant en cellules Neuro2A et 9L. Ces cellules adhèrent mal au support en verre traité à la gélatine et se détachent lors des incubations et des lavages successifs.

Nous pouvons conclure que c’est la partie N-terminale de la protéine XBTBD6 contenant le domaine BTB-POZ qui induit la localisation de la protéine XBTBD6 dans les corpuscules cytoplasmiques.

C A B + + + + - -- + -- - + IP : HA WB : MYC WB : MYC MYC-XBTBD2 HA-XBTBD6 HA-XBTBD6-(N term) HA-XBTBD6-(C term) + + + + - -- + -- - + IP : HA WB : MYC WB : MYC MYC-XBTBD6 HA-XBTBD6 HA-XBTBD6-(N term) HA-XBTBD6-(C term) + + + + - -- + -- - + IP : HA WB : MYC WB : MYC MYC-XBTBD3 HA-XBTBD6 HA-XBTBD6-(N term) HA-XBTBD6-(C term) - 75 kDa - 75 kDa WB : HA WB : HA WB : HA - 37 kDa - 75 kDa

Figure 26 : Analyse par immunoprécipitation des propriétés d’homodimérisation et d’hétérodimérisation de XBTBD6. Pour surexprimer les différentes protéines, nous avons transfecté de façon transitoire des cellules COS7 avec les différentes constructions. Après 24 heures de culture les cellules sont lysées et les associations protéiques sont analysées par immunoprécipitation et western blot. Les gels du bas de la figure (notés WB : MYC et WB : HA) correspondent au western blot utilisant les anticorps primaires dirigés respectivement contre l’épitope MYC et HA mettant en évidence primaires dirigés respectivement contre l épitope MYC et HA mettant en évidence l’expression des constructions dans le lysat cellulaire avant la précipitation. Les gels du haut de la figure (notés IP : HA WB : MYC) correspondent au western blot utilisant les anticorps primaires dirigés contre l’épitope MYC mettant en évidence les protéines précipitées à l’aide de l’anticorps HA. (A) Les résultats montrent que XBTBD6 homodimérise et cette homodimérisation nécessite la partie N-terminale contenant le domaine BTB-POZ. (B et C) De plus XBTBD6 hétérodimérise avec XBTBD3 ainsi qu’avec XBTBD2, et cette hétérodimérisation nécessite la partie N-terminale contenant le domaine BTB-POZ.

RESULTATS

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III.1.5. XBTBD6 homodimérise et hétérodimérise avec XBTBD3 et

Dans le document Caractérisation du gène XBTBD6 codant pour une protéine à domaine BTB-POZ impliquée dans la neurogenèse chez le xénope (Page 55-61)