La surexpression de XBTBD6 régule négativement la croissance des neurites

des neurites.

Nos travaux montrent que le gène XBTBD6 est fortement exprimé dans les neurones primaires et qu’il code pour une protéine interagissant avec l’E3 ubiquitine ligase XCullin-3. XBTBD6 pourrait donc être un membre du groupe des protéines adaptatrices participant à un complexe d’ubiquitination de type BTB-Cullin-3. Or l’ubiquitination est un mécanisme important régulant la croissance des neurites dans les neurones en différentiation. Nous nous sommes donc demandé si XBTBD6 joue un rôle au cours de la neurogénèse au niveau de la formation des neurites.

Pour étudier cette possibilité nous avons transfecté transitoirement la construction XBTBD6-GFP dans les cellules Neuro2A et induit la différentiation neuronale en ajoutant 20µM d’acide rétinoïque. Comme contrôle expérimental nous avons transfecté transitoirement la construction pCMV-GFP et induit de la même manière que précédemment la différentiation neuronale. Après trois jours de culture, sous observation au microscope à fluorescence, il est possible de visualiser les neurites en formation dans les cellules fluorescentes. L’observation directe dans le visible ne permet pas de déterminer avec précision ni la taille, ni la cellule d’origine des neurites. Par contre, l’observation des neurites issues d’une cellule et l’évaluation de sa taille sont possibles dans les cellules fluorescentes. Nous avons ainsi compté sur une population d’au minimum 100 cellules celles présentant la formation de neurites ayant une taille d’au moins une fois et demi la taille du corps cellulaire de la cellule dont elles sont issues (Tableau 1). Les résultats montrent que 80% des cellules transfectées avec la protéine GFP sont positives, résultats en accord avec ce qui est décrit dans la littérature (Sato et al., 2002). Par contre, il n’y a que 40% des cellules transfectées avec la protéine XBTBD6-GFP qui sont positives (Figure 35). Ces résultats préliminaires

Tableau 2 : Résultats des trois expériences de surexpression de XBTBD6 et de ses mutants de délétion XBTBD6 Nterm et XBTBD6 Cterm en cellules Neuro2A en différenciation. Les cellules Neuro2A sont transfectées transitoirement avec les constructions codant pour la GFP etet la protéine d’intérêt. La proportion de transfection est de un volume de construction codant pour la GFP pour 4 volumes de vecteur codant pour la protéine d’intérêt. Quand les cellules adhèrent bien au support, la différentiation neuronale est induite par 20µM d’ajout d’acide rétinoïque (RA). Après 3 jours de culture, les cellules sont traitées pour être observée en fluorescence au microscope. Sur une population d’au minimum 100 cellules, les cellules présentant au moins it d’ t ill d’ i f i t d i l t ill d ll l i d t ll t i t une neurite d’une taille d’au moins une fois et demi la taille du corps cellulaire dont elle est issue sont considérées comme positives. Les résultats montrent que 80% des cellules transfectées avec la protéine GFP et induites au RA sont positives. Nous observons que 40% des cellules transfectées avec la GFP et la protéine XBTBD6 et induites au RA sont positives. Ces résultats sont concordants avec ceux que nous avons obtenus dans l’expérience précédente suggérant que XBTBD6 contrôle négativement la croissance des neurites. De plus, les résultats obtenus avec les cotransfections GFP+LacZ, GFP+Nd1L et GFP+NAC1 suggèrent que l’effet obtenu avec XBTBD6 est spécifique. Les cotransfections GFP+XBTBD6 Nterm et GFP+XBTBD6 Nterm montrent que seul la partie C-terminale induit le contrôle négatif de la croissance des neurites.La même expérience a été réalisée trois fois, les résultats ont été analysés et sont statistiquement significatifs (p<0 05)

analysés et sont statistiquement significatifs (p<0,05).

30 40 50 60 70 80 90 100 ellu les av ec n eu rit es ( % ) 0 10 20 30 C e GFP LacZ + GFP XBTBD6 + GFP Nd1L + GFP NA C1 + GFP 1 BD6 Nter m + GFP BD6 Cter m + GFP - RA + RA - RA + RA

Figure 36 : Résumé des résultats du tableau 2 par représentation en histogramme.Chaque valeur représente la moyenne ± la déviation standard des triplicats.

44 bis

XBT XBT

RA RA

RESULTATS

45 suggèrent que la protéine XBTBD6 jouerait un rôle dans le contrôle négatif de la croissance des neurites.

Afin de confirmer ces résultats nous avons d’une part vérifié la spécificité de l’effet de XBTBD6 en cotransfectant avec la GFP d’autres constructions n’ayant pas de rôles connus dans la neuritogenèse et d’autre part étudié les effets de la surexpression de mutants de délétion de XBTBD6.

Pour vérifier la spécificité de l’effet de XBTBD6, nous avons cotransfecté en plus de la construction codant pour la GFP précédement utilisée, les constructions codant pour la β– galactosidase (LacZ) et pour deux protéines à domaines BTB-POZ, les protéines murines Ncx

downstream gene 1 long form (Nd1-L) et Nucleus Accumbens-1 (NAC1). Nd1-L est une protéine présentant la succession des domaines BTB-POZ, BACK et Kelch dont la fonction est partiellement caractérisée. Il a été montré que Nd1-L est un gène exprimé de manière ubiquitaire. Nd1-L interagit avec les molécules d’actine et la surexpression de Nd1-L en NIH3T3 permet aux cellules de résister à la cytochalasin D qui est un déstabilisateur du cytosquelette (Sasagawa et al., 2002). La structure de Nd1L peut faire supposer que cette protéine possède la fonction d’adaptateur dans un complexe BTB-Cul3. NAC1 est une protéine présentant un domaine BTB-POZ sans autre domaine caractérisé. Cette protéine est présente dans divers tissus dont ceux du système nerveux central. NAC1 est ainsi détectée dans les neurones murins. Il a été montré que c’est un corépresseur transcriptionnel qui interagit, sans faire intervenir le domaine BTB-POZ, avec deux HDACs (histone deacetylase) (Korutla et al., 2005). Afin de compléter l’étude de XBTBD6, nous avons étudié les effets de la surexpression des différentes parties de la protéine XBTBD6. Nous avons transfecté les mutantsde délétion de XBTBD6 précédement décrit, XBTBD6-Nterm et FLAG-XBTBD6-Cterm.

Nous avons cotransfecté transitoirement, dans les cellules Neuro2A, les constructions LacZ, Nd1-L, NAC1, FLAG-XBTBD6-Nterm, FLAG-XBTBD6-Cterm avec la construction codant pour la GFP dans la proportion en quantitée de 1/5 de GFP pour 4/5 de vecteur d’intérêt. Comme dans les conditions de l’expérience précédente nous avons induit la différentiation neuronale en ajoutant 20µM d’acide rétinoïque puis compté les cellules

correspondantes aux critères précédement décrit (Tableau 2). Dans ces conditions nous

obtenons pour l’expression de la GFP seule et pour la coexpression de la GFP avec XBTBD6 des résultats semblables à ceux obtenus dans l’expérience précédente (Figure 35). En effet, la coexpression de XBTBD6 et de la GFP entraine une diminution de 50% du nombre de cellules Neuro2A présentant des neurites en comparaison des cellules exprimant uniquement

RESULTATS

46 la GFP. Ces résultats montrent que les deux approches expérimentales consistant d’une part à tranfecter une construction codant pour une protéine d’intérêt en fusion avec la GFP et d’autre part à cotransfecter deux constructions codant pour la protéine d’intérêt et la GFP donnent, dans nos conditions, des résultats concordants validant ainsi l’approche technique. Les résultats montrent de plus que les constructions LacZ, Nd1-L et NAC1 n’induisent pas d’effets observables. Ces données suggèrent que l’effet de XBTBD6 semble être spécifique. De façon intéressante nous observons de plus que le mutant FLAG-XBTBD6-Nterm n’induit pas d’effets observables alors que le mutant FLAG-XBTBD6-Cterm semble contrôler la

croissance des neurites de la même manière que la protéine entière (Figure 36). Nous

pouvons supposer que la partie C-terminale de XBTBD6 s’associe avec une protéine cible. Dans notre modèle hypothétique l’interaction de XBTBD6 avec cette protèine mène à l’ubiquitination et la dégradation de la cible, dans le cas présent, il est possible que l’interaction de la partie C-terminale de XBTBD6 avec sa cible induise une inactivation de la protéine cible entrainant le contrôle négatif de la croissance des neurites.

Ces résultats permettent de supposer que la protéine XBTBD6 est impliquée dans l’ubiquitination et la dégradation d’une cible protéique dont la conséquence est un contrôle négatif de la croissance des neurites dans les neurones en différentiation.

III.5. Recherche de partenaires protéiques de XBTBD6 par criblage