Utilisation des vecteurs appâts pPC97-XBTBD6, pPC97-XBTBD6 N-term et

N-term et pPC97-XBTBD6 C-term.

Nos travaux nous ont permis d’établir l’hypothèse selon laquelle XBTBD6 serait une protéine adaptatrice entre l’ubiquitine ligase XCullin-3 et une cible spécifique. Cette cible serait ubiquitinée et cette ubiquitination entraînerait un contrôle négatif de la croissance des neurites dans les neurones en différentiation.

Pour étayer cette hypothèse, nous avons essayé d’identifier la ou les cibles de XBTBD6. Nous avons décidé d’utiliser la technique de criblage par double hybride en levures. Nous avons choisi cette technique car elle est bien établie dans l’institut et qu’une bibliothèque à été réalisée à partir d’embryons de xénopes par R. Van Wayenbergh dans le

Gal4 TA ? Gal4 TA ? Gal4 TA G l4 BD XBTBD6 Gal4 BD promoteur HIS3/ADE2/LacZ Gal4 BD XBTBD6

Figure 37 : Principe du système de recherche de partenaire protéine en double hybride en levure.Une cellule hôte est cotransformée avec les plasmides appât et proie. Ceux-ci expriment des constructions fusions qui permettent l’interaction de la protéine appât (ici l’exemple est XBTBD6) avec une protéine proie. Cette interaction reconstitue une protéine Gal4 fonctionnelle qui peut alors activer la transcription des gènes rapporteurs (HIS3/ADE2/LacZ). Les gènes HIS3 et ADE2 permettent une sélection sur milieux carencés en histidine et/ou en adénine. Le gèneLacZpermet une sélection chromogénique par détection de l’activité de la

β-galactosidase.

RESULTATS

47 laboratoire de l’IRIBHM du Docteur D. Christophe. De plus il a aimablement mis à notre disposition le matériel et les protocoles.

La technique de recherche de partenaire par double hybride en levure est basée sur la reconstitution de l’activité transcriptionnelle du facteur de transcription GAL4. Initialement la protéine GAL4 est constituée par un domaine de liaison à l’ADN (GAL4-BD) et par un domaine transactivateur (GAL4-TA). Dans cette technique ces deux domaines sont fusionnés avec une protéine. GAL4-BD est fusionné avec une protéine d’intérêt (l’appât) tandis que GAL4-TA est fusionné avec un ADNc provenant d’une banque (la proie). Si l’appât et la proie interagissent, cela reconstitue une protéine GAL4 fonctionnelle qui peut activer la transcription de gènes rapporteurs. La souche de levure utilisée contient trois gènes rapporteurs dont la transcription est sous la dépendance d’un promoteur contenant des sites de liaison pour la protéine Gal4, les gènes HIS3, ADE2 et LacZ. Cette souche de levure est auxotrophe pour les acides aminés adénine et histidine ainsi l’expression des ces gènes permet aux levures de croitre sur un milieu carencé en adénine et histidine. Le gène LacZ

permet une détection chromogénique par le test X-gal (Figure 37).

Nous avons généré les vecteurs appâts pPC97 contenant la séquence codant pour XBTBD6 ainsi que les séquences codant pour la partie N-terminale et la partie C-terminale de XBTBD6 (pPC97-XBTBD6, pPC97-XBTBD6-Nterm et pPC97-XBTBD6-Cterm)

(Figure 38). Ces deux dernières constructions appâts devaient nous permettrent d’étudier

ultérieurement les parties de la protéine XBTBD6 qui interviennent dans l’interaction avec d’éventuels partenaires. Nous avons transformé la souche de levure PJ69-4A et sélectionné les clones de levures pouvant pousser sur le milieu carencé en leucine. Nous avons vérifié la présence des vecteurs dans les clones de levure sélectionnés en effectuant une préparation d’ADN plasmidique sur laquelle nous avons effectué une PCR à l’aide d’amorces spécifiques. La construction appât que nous utilisons ne doit pas elle-même activer les gènes rapporteurs. Nous avons donc contrôlé que les levures transformées ne poussent pas sur les milieux carencés en histidine et adénine sulfate et ne donnent pas de coloration bleue aux tests X-gal en milieu liquide. L’ensemble de ces contrôles s’est avéré positif pour l’utilisation du vecteur appât pPC97-XBTBD6, cette construction est donc adaptée pour rechercher la ou les cibles potentielles de XBTBD6 par criblage par double hybride en levures. Par contre, nos constructions appâts pPC97-XBTBD6-Nterm et pPC97-XBTBD6-Cterm induisent l’activation du gène rapporteur β-galactosidase, ce qui ne nous permet pas leur utilisation dans des tests d’interaction. Nos analyses informatiques de la séquence de la protéine XBTBD6 ou de ses mutants ne donnent pas d’indication concernant la présence de domaine

Gal4BD BTB-POZ BACK région PHR COOH NH₂

XBTBD6

Figure 38 : Représentation des différentes constructions utilisées pour la recherche de partenaires protéiques pour XBTBD6 en double hybride en levures.

Nous avons cloné dans le vecteur d’expression pC97 en phase avec le domaine de

BTB-POZ région PHR COOH

NH₂

COOH COOH

XBTBD6-Nterm

Gal4BD BACK région PHR COOH

NH₂

XBTBD6 sans domaine BTB

g

Gal4BD

NH₂

XBTBD6-Cterm Gal4BD région PHR

Nous avons cloné dans le vecteur d expression pC97 en phase avec le domaine de liaison à l’ADN de Gal4 (Gal4BD), les séquences codantes pour XBTBD6, XBTBD6 sans le domaine BTB-POZ ainsi que les moitiés N-terminale (XBTBD6-Nterm) et C-terminale (XBTBD6-Cterm) de la protéine. 60 80 100 s id a se ( % d u C + ) 0 20 40 A c tiv ité β -g al act o s 0 C+ C-XBT BD⁶ Xl^BT BD⁶ sa^ns do^m ai^ne BT^B XB^TB D6 ^N ter^m XB^TBD 6 ^Cte rm^.

Figure 39 : Contrôle de l’activation du gène rapporteur LacZ des clones de levures transformés avec les différentes constructions appâts XBTBD6. L’activité β -galactosidase a été mesurée par la méthode SDS-chloroforme et est exprimée en pourcentage de l’activité β-galactosidase du contrôle. Les appâts constitués par la protéine XBTBD6 entière ou sans le domaine BTB-POZ n’induisent pas l’activation du gène rapporteur LacZ. Par contre les appâts constitués par les moitiés N-terminale et C-terminale de XBTBD6 induisent l’activation du gène rapporteur et ne sont donc pas utilisables pour un criblage

utilisables pour un criblage.

RESULTATS

48 activateur de la transcription dans ces séquences. La capacité des mutants XBTBD6 d’activer le gène rapporteur chromogénique peut être expliqué par l’acquisition artificielle d’une conformation suceptible de recruter la machinerie transcriptionnelle. Cette acquisition artificielle peut découler du fait que nous travaillons avec une séquence de XBTBD6 qui n’est plus dans son environement naturel. En effet nous travaillons avec une séquence partielle, fusionnée avec une séquence d’une autre protéine, dans un environement cellulaire d’une autre espèce et dans des conditions expérimentales artificielles par nature. L’une où l’autre de ces suppositions peut être la cause des résultats que nous avons obtenus avec les mutants de XBTBD6 (Figure 39).

La transformation à grande échelle pour le criblage par double hybride à permis d’obtenir environ 5 millions de doubles transformants contenant le vecteur appât pPC97-XBTBD6 et un vecteur proie pPC86 contenant l’ADNc d’une protéine partenaire potentielle. Après étalement sur milieu carencé en adénine sulfate et histidine les 100 clones ayant pu croître le plus rapidement et ayant un diamètre d’au moins 1 millimètre ont été sélectionnés et repiqués sur milieu carencé en adénine sulfate et histidine fraîchement préparé. Cette sélection a donné 56 clones qui ont été testés par test X-gal sur milieu solide. Tous les clones ont développé une coloration bleue et ont été amplifiés pour permettre la purification des ADNc plasmidiques. Les inserts contenus dans les vecteurs proies sont amplifiés par PCR à l’aide d’amorces spécifiques complémentaires de séquences contenues dans le vecteur proie et encadrant le site ce clonage. Les inserts ont ensuite été purifiés puis séquencés à l’aide d’une amorce permettant de déterminer la séquence de la jonction entre le domaine d’activation transcriptionnelle de Gal4 et l’insert contenu dans le vecteur proie. Le séquençage permet de déterminer si nous avons l’ATG initiateur de la traduction de la séquence de la protéine proie. Si le séquençage ne le permet pas nous l’indiquerons pour chaque séquence proie analysée. Le séquençage permet d’obtenir environ 500 pb. Si la séquence proie est plus longue, il n’est pas possible de déterminer la séquence dans sa totalité. Nous avons eu ce cas de figure pour tous les clones que nous avons séquencés. Les séquences sont ensuite analysées par comparaison aux bases de données informatiques à l’aide du programme BLAST.

Nous avons déterminé que 39 séquences correspondaient à la protéine XBTBD6 elle-même, 9 séquences correspondaient à la protéine XBTBD3. Ces résultats confirment nos travaux précédents qui ont montré en immunoprécipitation l’homodimérisation de XBTBD6 et son hétérodimérisation avec XBTBD3. De plus ils valident le système de surexpression en levure où XBTBD6 est bien traduit et conserve une conformation permettant

RESULTATS

49 l’homodimérisation et son hétérodimérisation avec XBTBD3. Cependant la présence répétée des séquences de XBTBD6 et de XBTBD3 dans nos séquences proies indique des interactions à forte affinité avec l’appât, ce qui a pu entraîner une sélection préférentielle des clones mettant en évidence ces interactions au détriment des clones correspondants à d’autres partenaires biochimiques. Cette hypothèse peut expliquer l’absence dans les séquences obtenues de XBTBD2 et de XCullin-3. Nous avons identifié aussi 10 autres protéines comme partenaires protéiques potentiels de XBTBD6 :

La séquence partielle n°29 code pour 66% de la protéine TLK (Tousled-Like Kinase) de xénope. Cette protéine est une kinase de type sérine/thréonine ayant des fonctions régulatrices dans l’organisation de la chromatine, la réparation de l’ADN, la réplication et la transcription (Carrera et al., 2003; Krause et al., 2003; Han et al., 2003). Il a été montré que TLK phosphoryle ASF1 (AntiSilencing Function 1) qui est une protéine chaperone des histones H3 (Sillje and Nigg, 2001).

La séquence partielle n°33 code pour 54% de la protéine PAP-1 (Pim-1-Associated Protein-1) de xénope. Cette protéine est impliquée dans le splicing des ARNm (Maita et al., 2004) et il a été montré que PAP-1 interagit avec la kinase Pim1 (Maita et al., 2000) et les facteurs de splicing CIR et U2AF35 (Maita et al., 2005).

La séquence n°42 code pour 67% de la protéine membranaire MAL2 (Myelin And Lymphocyte 2). Cette protéine joue un rôle dans la transcytose (Marazuela et al., 2004b). L’inhibition de la protéine MAL2 n’empêche pas l’internalisation des récepteurs mais entraîne l’accumulation périnuclaire des vésicules de transport (de Marco et al., 2002). De manière intéressante il a été montré que la protéine MAL2 est localisée dans de nombreux tissus et types cellulaires et en particulier dans les neurones périphériques et les cellules dendritiques (Marazuela et al., 2004a).

La séquence n°45 code pour 47% de la sous unité 4γ du facteur d’initiation de la traduction eIF3 (eukaryotic Initiation Factors 3) (pour revue (Pisarev et al., 2005). Nous n’avons pas déterminé avec précision l’ATG initiateur de la traduction. Notons qu’il a été

montré que eIF3-4 γ est sous la régulation protéolytique du protéasome 20S (Baugh and

Pilipenko, 2004)

La séquence n°46 code pour 65% de la protéine CYP2C8 (Cytochrome P450, family 2, subfamily C, polypeptide 8). Nous n’avons pas déterminé avec précision l’ATG initiateur de la traduction. Il s’agit d’une forme du cytochrome p450, enzyme dont l’activité est le catabolisme de xénobiotiques (Totah and Rettie, 2005).

RESULTATS

50 La séquence n°50 code pour 77% de la protéine KTR14 (Keratin 14). Nous n’avons pas déterminé avec précision l’ATG initiateur de la traduction. Cette protéine est une kératine de type I qui forme un hétérotétramère en s’associant avec une protéine semblable et avec deux kératines de type II. Cette macromolécule est l’élément principal du cytosquelette des cellules épithéliales (Ravindranath et al., 2003).

La séquence n°56 code pour 35% de la protéine FBLN1 (Fibulin 1). Cette protéine est une glycoprotéine sécrétée qui s’intègre dans la matrice extracellulaire (Argraves et al., 1989)

Les séquences 26 et 37 codent pour respectivement 60% et 65% de la protéine UBE2I (aussi nommée UBC9 chez la levure). Cette protéine est une enzyme dont la fonction est la conjugaison d’un groupe peptidique SUMO sur une protéine substrat (Desterro et al., 1997). Cette fonction s’apparente à l’activité des enzymes de conjugaison de l’ubiquitine E2. D’autre part, il a été montré que UBE2I permet de sumoyler la topoisomerase I (Mao et al., 2000a).

La séquence n°44 code pour 65% de la protéine PIAS1 (Protein inhibitor of activated STAT 1). Cette protéine interagit avec la protéine UBE2I, c’est une sumo ligase E3 qui sumoyle les protéines c-jun et p53 (Schmidt and Muller, 2002).