Utilisation de peptides synthétiques marqués

L’utilisation de peptides marqués par des isotopes stables permet, selon leur degré de pureté, d’obtenir une quantification relative ou absolue. Des peptides synthétiques, identiques en séquence aux peptides protéotypiques sélectionnés, sont incorporés dans l’échantillon à analyser. Cette incorporation est réalisée juste avant l’analyse en LC-SRM, c’est-à-dire après les étapes d’extraction et de digestion des protéines endogènes. Ces peptides synthétiques sont marqués par les isotopes stables 13C ou 15N sur les lysines et arginines en position N-Ter, ce qui engendre un décalage du rapport m/z de 4 Da par rapport au peptide endogène. La quantification pour chaque peptide est obtenue par le ratio entre les formes lourdes (synthétiques) et légères (endogènes).

Différents types de peptides synthétiques sont disponibles et utilisés selon la méthode de dilution des isotopes stables (SID, Stable Isotope Dilution) :75

- des peptides marqués mais non quantifiés de façon précise (PEPotec™, Thermo Fisher Scientific). Ils présentent l’avantage d’un coût moins important, mais ils ne permettent que d’obtenir une quantification relative entre les différents échantillons,

- des peptides AQUA™ (Thermo Fisher Scientific) purifiés et parfaitement quantifiés. Le mélange de ces peptides en quantité connue dans l’échantillon permet d’obtenir une quantification absolue.

Il faut cependant tenir compte du biais induit par le fait que ces peptides de référence ne sont pas soumis, comme indiqué précédemment, aux mêmes étapes de préparation que l’échantillon à analyser.

D’autres approches de quantification par méthode SRM ont également été développées :

- utilisation de standards QconCAT™ : une protéine chimérique formée par les peptides sélectionnés est produite par expression dans des cultures d’E. Coli en milieu contenant des arginines et lysines marquées⁷⁶,

- utilisations de standards PSAQ™ (Protein Standard Absolute Quantification) : la protéine marquée utilisée comme standard est identique en terme de séquence à la protéine endogène ciblée.77

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Ces standards protéiques marqués ont l’avantage d’être intégrés dès les premières étapes du traitement de l’échantillon, ce qui permet de limiter les biais liés aux différentes étapes de préparation des échantillons. Ce sont cependant des techniques beaucoup plus couteuses, de mise en œuvre plus compliquée et qui ne sont applicables qu’à un nombre limité d’échantillons.

Dans mon travail de thèse j’ai utilisé une approche par SRM basée sur une quantification relative avec utilisation de peptides standards de type PEPotec™.

2.2.2. Instrumentations

L’approche SRM repose sur l’utilisation de spectromètres de type triple-quadripôles. Dans ce mode d’analyse, chaque quadripôle a une fonction distincte (figure 12) :

- le premier quadripôle permet la sélection du précurseur selon son rapport m/z,

- le précurseur sélectionné est fragmenté dans le deuxième quadripôle (fragmentation de type CID (Collision Induced Dissociation)),

- le troisième quadripôle permet de sélectionner un fragment donné selon son rapport m/z pour suivre une transition déterminée.

Figure 12

Sélection des peptides précurseurs et des transitions sur un instrument de type triple-quadripôles.

Ces analyseurs permettent de sélectionner spécifiquement les transitions à suivre au sein d’un échantillon avec une gamme dynamique élevée. Au cours de ce travail de thèse j’ai utilisé l’appareil TSQ Vantage (Thermo Scientific) couplé au système chromatographique Ultimate 3000.

Le paramétrage de la méthode permet d’établir le temps de cycle (durée des cycles pendant lesquels les transitions choisies sont acquises). Ce temps de cycle dépend donc du nombre de transitions à suivre et de la durée pendant laquelle chaque transition est suivie. Ce temps de cycle ne doit pas être trop long pour permettre d’acquérir suffisamment de points (idéalement une dizaine) pour définir précisément chaque pic sur le tracé chromatographique.

49 2.2.3. Traitement des données

L’analyse repose sur l’extraction des courants d’ions des peptides sélectionnés pour chaque transition (peptides endogènes et standards). Les aires sous la courbe des courants d’ions de chaque transition sont intégrées puis additionnées pour chaque peptide. Des logiciels permettent de réaliser ces étapes de façon automatisée, mais il est souvent nécessaire de vérifier manuellement la bonne intégration des pics. Dans ce travail de thèse j’ai utilisé le logiciel en accès libre Skyline78 pour l’analyse des données de SRM.

Ce logiciel, dont l’utilisation n’est cependant pas restreinte aux approches ciblées, nécessite au préalable la constitution d’une librairie de spectres établie à partir des peptides sélectionnés. Il offre l’avantage de pouvoir vérifier, et corriger si besoin, l’intégration des pics. Cette vérification manuelle est cependant fastidieuse si un grand nombre de peptides doit être quantifié.

La quantification relative ou absolue, selon le standard interne utilisé, est obtenue par la mesure du ratio entre l’isotope lourd synthétique et l’isotope léger présent biologiquement dans l’échantillon. Ces ratios, calculés pour chaque échantillon, permettent la comparaison des échantillons (figure 13).

Figure 13

Exemple de quantification relative par SRM obtenue à l'aide du logiciel Skyline. Le ratio des intensités entre le peptide lourd et le peptide endogène est déterminé dans chaque échantillon. Ces ratios permettent de comparer les échantillons entre eux. Dans cet exemple le ratio calculé entre les deux échantillons est de 2,33.

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3. C

Les approches protéomiques par spectrométrie de masse ont considérablement évolué ces dernières années. Une quantification relative sans marquage de plusieurs milliers de protéines peut être obtenue actuellement à partir d’échantillons complexes en quelques heures d’analyse.

Le développement des approches quantitatives ciblées permet une quantification extrêmement sensible et spécifique de protéines sélectionnées au préalable.

Ces deux types de quantification sans marquage permettent d’utiliser ces approches pour les phases de découvertes de biomarqueurs (approche quantitative globale) et pour leur validation ultérieure (approche quantitative ciblée).

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Partie II

Projets de recherches