Génération des microparticules induites et validation en tant que sous-protéome enrichi en protéines membranaires en protéines membranaires

Les travaux initiaux ont permis de mettre au point la procédure expérimentale pour la génération et l’analyse protéomique des MP.89

Les différentes étapes ont été :

- la génération in vitro de MP induites en grande quantité par stimulation des cellules avec de l’actinomycine D ou de la phyto-hémagglutinine en travaillant sur des lignées cellulaires de lymphocytes T (CEM).

- l’isolement des MP dans le surnageant du milieu de culture par ultra-centrifugations (45 minutes à 15000 g),

- l’extraction des protéines à l’aide de SDS et séparation par gels SDS-PAGE 1D (gels avec séparation sur 20 cm et gradient de polyacrylamide 8-15 %),

- la découpe systématique des gels en bandes de 2 mm, réduction/alkylation des cystéines puis digestion trypsique avant extraction des peptides,

- analyse nanoLC-MS/MS (CapLC (Waters) couplée à un Q-TOF II (Waters)).

Ces travaux ont permis d’identifier 390 protéines issues de ces préparations de MP induites avec 34 % de protéines membranaires. La répartition des différentes localisations cellulaires des protéines identifiées est représentée dans la figure 15. La répétabilité de cette procédure a également pu être établie avec 70 % d’identifications communes entre 3 préparations différentes de MP.

59 Figure 15

Répartition des localisations cellulaires des protéines identifiées à partir de MP (d’après référence n^o 89).

2.2. Identification du CD148

La possibilité d’utiliser les MP induites comme sous-protéome enrichi en protéines membranaires ayant été démontrée, cette stratégie a été appliquée pour la comparaison du protéome des MP issues des différents types de syndromes lymphoprolifératifs : lymphome à cellules du manteau, leucémie lymphoïde chronique et lymphome de la zone marginale.

Au total 150 millions de lymphocytes ont été obtenus à partir du sang périphérique et stimulées en culture in vitro par l’actinomycine D pendant 18 heures. Après collecte des MP par centrifugations différentielles, les protéines ont été extraites et solubilisées dans un tampon à base de SDS et séparées sur gel SDS-PAGE 1D (gel de 20 cm avec gradient de polyacrylamide 8-15 %). Les mêmes étapes que précédemment ont été réalisées pour la découpe du gel, la digestion des protéines et l’extraction des peptides. Les analyses nanoLC-MS/MS ont été réalisées sur un couplage CapLC (Waters) Q-TOF II (Waters).

60

Une liste de 579 protéines non redondantes a pu être établie à partir de ces trois échantillons. Différents filtres ont été appliqués pour aboutir à une liste de candidats biomarqueurs : protéines associées à la membrane cytoplasmique et exprimées différentiellement selon les types d’hémopathies avec applications sur les candidats potentiels de critères stringents de validation (validation manuelle des spectres et au moins cinq séquences peptidiques différentes par protéine identifiée). Une liste finale de cinq protéines a ainsi pu être établie (tableau 5 et figure 16).90

Protéine ^{Nombre de peptides validés}

LLC LZM LCM

Receptor-type tyrosine-protein phosphatase eta (CD148) 0 4 10

Chloride intracellular channel protein 1 0 5 6

HLA class I histocompatibility antigen, A-24 alpha chain 0 0 6

Plexin-A1 0 0 9

Transgelin-2 0 0 6

Tableau 5

Nombre de peptides identifiés et validés pour les cinq protéines de la liste finale à partir de laquelle a été identifié le CD148.

Figure 16

Illustration des différents filtres appliqués à partir de la liste initiale de protéines identifiées pour aboutir à la sélection du CD148 (d’après référence n^o 90).

61 La dernière étape a consisté à confronter ces biomarqueurs potentiels avec leurs fonctions biologiques et les données de la littérature. Cette étape a permis d’extraire de cette liste le CD148 (DEP-1/HPTPη) comme un biomarqueur d’intérêt. Il s’agit d’un récepteur membranaire à activité tyrosine phosphatase, caractérisé initialement en 1994.⁹¹ Le domaine extracellulaire de la protéine est composé d’une répétition de 8 à 10 domaines de type fibronectine III. Le domaine intracellulaire ne contient qu’un domaine catalytique à activité tyrosine phosphatase. Le poids moléculaire varie entre 220 et 250 kDa selon l’état de glycosylation. Le gène PTPRJ, localisé en 11p11.2, a une taille de 180 kb et comporte 25 exons.

Le CD148 est exprimé dans de nombreux tissus dont la majorité des épithéliums à différenciation glandulaire.92 Au sein de la lignée hématopoïétique, l’expression la plus forte est détectée au niveau de la lignée granuleuse, l’expression par les lymphocytes B étant intermédiaire et non modifiée après stimulation93. In vitro ce récepteur intervient dans le contrôle de la prolifération, de la migration et de l’adhésion cellulaire.^94,95 La fonction exacte du CD148 dans les lymphocytes B n’est pas connue, mais des études immunohistochimiques suggèrent qu’il pourrait être un marqueur des lymphocytes B mémoires.96

L’expression du CD148 est conservée dans différents types d’adénocarcinomes (mammaire, gastrique ou colique par exemple).⁹² De nombreux travaux attribuent à ce récepteur un rôle suppresseur de tumeur dans le développement de pathologies malignes. Dans des lignées cellulaires humaines de cancer du côlon déficientes en CD148, la réexpression du gène entraîne une diminution de la croissance et de la migration des cellules tumorales.97 Chez l’homme, une perte d’hétérozygotie du gène PTPRJ a été mise en évidence dans des cas de cancer du côlon, du sein ou de la thyroïde.98,99

2.3. Identification du CD180

Une approche similaire à celle ayant permis l’identification du CD148 a été appliquée dans un deuxième projet de recherche mené dans le laboratoire. Le matériel biologique de départ était toujours constitué de MP induites générées à partir de cellules provenant de trois patients (lymphome à cellules du manteau, lymphome lymphoplasmocytaire et lymphome de la zone marginale).¹⁰⁰

62

Les différences par rapport au projet précédent ont porté sur :

- l’utilisation d’un couplage nanoLC-MS/MS de type nanoACQUITY UPLC (Waters) couplée à un spectromètre de masse de type Q-TOF Synapt G1 (Waters) plus récent,

- la réalisation de deux injections de chaque bande du gel pour augmenter le pourcentage de couverture du protéome,

- l’utilisation de deux moteurs de recherche (Mascot et OMSSA) en ne conservant que les protéines identifiées conjointement par les deux algorithmes.

Le nombre total de protéines ainsi identifiées était de 2016, 1476 et 1066 pour les échantillons LZM, LLP et LCM respectivement (1977 protéines non redondantes au total). Cette liste de protéines a ensuite été restreinte pour ne conserver que les protéines membranaires associées à un cluster de différenciation et identifiées avec au moins deux peptides. Au final une liste de 59 protéines a pu être établie (annexe 1). Ces résultats ont à nouveau été confrontés aux données biologiques et de la littérature afin de définir dans la liste de protéines les biomarqueurs potentiels les plus pertinents. Le tableau 6 indique les résultats des comptages de peptides et de spectres obtenus pour le CD180.

LZM LLP LCM

Nombre de peptides 9 0 2

Nombre de spectres 29 0 14

Tableau 6

Nombres de peptides et de spectres obtenus pour l'identification du CD180 dans chaque type de syndrome lymphoprolifératif.

Le CD180 (également appelé RP105 (Radio Protective 105)) est une protéine de 95 kDa. C’est un récepteur membranaire appartenant à la famille des récepteurs de type Toll-Like (TLR, Toll-Like

Receptors), impliqué dans l’activation des lymphocytes B.^101,102 Cette famille de récepteurs, composée de dix membres chez l’Homme (TLR1 à 10), joue un rôle majeur dans l’immunité innée et acquise. Les voies de signalisation impliquant les TLR font intervenir différentes protéines adaptatrices, dont MYD88 (Figure 17).103

63 Figure 17

Voies de signalisations impliquant les récepteurs TLR (d’après référence n^o 103).

Les lymphomes de la zone marginale, en particulier les formes spléniques, se caractérisent par une activation de la voie NK-kB suite à l’activation des voies de signalisation du récepteur des lymphocytes B (BCR) et des TLRs.104 Des mutations récurrentes du gène MYD88, dont la protéine MYD88 est un adaptateur essentiel dans la voie de signalisation des TLR, ont été décrites dans les lymphomes spléniques de la zone marginale avec une fréquence d’environ 15 %.¹⁰⁵

Il existait donc un rationnel biologique fort pour poursuivre les investigations concernant le CD180 et évaluer son niveau d’expression dans les lymphomes de la zone marginale.

64