L’analyse de ces trois marqueurs a été réalisée par cytométrie en flux (CD148 (Clone 143-41 FITC); CD180 (Clone G28.8 PE) et CD200 (Clone OX104 APC)). Leur profil d’expression a été établi sur une cohorte de 114 patients bien caractérisés : LLC avec un score de Matutes > 3 (N=34); LCM caractérisés par une translocation t(11;14) et/ou une sur-expression de CCND1 (N=22); LLP (N=26) présentant une morphologie évocatrice, un pic IgM et une positivité du CD38 ; des LZM (N=32) avec un phénotype CD5- CD23- associé à une splénomégalie. Pour chaque groupe la moyenne des MFI et l’erreur standard ont été déterminées.
Résultats
L’analyse par cytométrie en flux des LCM révèle une forte expression du CD148 (MFI moyenne = 1498) associée à une faible expression des CD180 et CD200 (MFI moyenne = 888 et 426 respectivement). A l’inverse, une faible expression du CD148 et du CD180 (MFI moyenne = 495 et 754) associée à une forte expression du CD200 (MFI moyenne = 3750) est caractéristique des LLC. Une faible expression du CD148 et du CD200 (MFI moyenne = 640 et 1200) associée à une très forte expression du CD180 (MFI moyenne = 5300) est le profil observé dans les LZM et enfin, une expression modérée de ces trois marqueurs représente le groupe des LLP (figures 1 et 2).
Un seuil correspondant à la moyenne des MFI +/- 4 SD a été calculé pour chacun des groupes. L’utilisation de ces seuils permet de classer correctement les LCM avec une spécificité de 96% et une sensibilité de 65%, les LLC avec une spécificité de 95% et une sensibilité de 79%, les LLP avec une spécificité de 95% et une sensibilité de 54 % et enfin les LZM avec une spécificité de 99% et une sensibilité de 60 % (tableau 1).
LLC LCM LZM LLP
LLC
LZM
LCM
LLP
Figure1: Exemples de profils d’expression des marqueurs CD148, CD180 et CD200 dans les LLC (violet) LCM (rouge) LZM (vert) et LLP (bleu).
Figure2: Représentation « radar » sur le logiciel Kaluza Analyses 1.3 de la combinaison de 10 LLC, 10 LLP, 10LCM et 10 LZM pour l’expression des marqueurs CD148, CD180 et CD200.
Tableau1: Seuils de fluorescence des marqueurs CD148, CD180 et CD200 dans les groupes de LLC, LZM LCM et LLP. L’application de ces seuils permet une classification des pathologies avec une spécificité et une sensibilité reportées ci-dessus. LLC LCM LZM LLP CD148 <690 >980 <1000 540< MFI <1350 CD180 <1150 <1500 >2700 500 < MFI < 1450 CD200 >500 <900 <2200 0 < MFI < 2700 Spécificité 95% 92% 99% 90% Sensibilité 79% 64% 60% 54%
Multicentric Analyses of the CD148, CD180, and CD200 Combination for the Diagnosis of Mature B-Cell Neoplasms Using Flow Cytometry
Laurent Miguet1,2,3, Luc Fornecker4, Marie Wyrwas5, Sarah Cianferani6, Raoul Herbrecht4, Jean-Francois Lesesve5, Véronique Latger-Cannard5, Caroline Mayeur-Rousse1and Laurent Mauvieux1,2,3
1Hôpital Hautepierre, Laboratoire d'hématologie, Strasbourg, France; 2Université de Strasbourg, EA3430, Strasbourg, France; 3FMTS, Strasbourg, France; 4Service d’Oncologie et d’Hématologie, Hôpital de Hautepierre, Strasbourg, France;
5Hôpital de Nancy, France; 6Laboratoire de spectrométrie de masse bioorganique (LSMBO) CNRS UMR 7178 institut pluridisciplinaire Hubert Curien Strasbourg, Strasbourg, France
METHODS
ABSTRACT RESULTS
1. Miguet et al. Journal of proteome research 2009 Jul;8(7):3346-54 2. Miguet et al. Leukemia. 2013 Aug;27(8):1748-50
3. Mayeur-Rousse et al. Cytometry B Clin Cytom. 2015 Sep 18.
Diagnosis of mature B-cells proliferations, do not always fulfill any of the WHO criteria of B-cell neoplasms using standard diagnosis tools. This situation is notably encountered in the case of the differential diagnosis of marginal zone lymphoma (MZL), atypical chronic lymphocytic leukemia (aCLL), mantle cell lymphoma (MCL), or lymphoplasmacytic lymphoma (LPL), mostly due to the lack of immunological positive markers.
In order to find new markers to discriminate between these different malignancies, we have previously developed a proteomic strategy based on the analyses of plasma membrane microparticles and proposed two new specific markers: CD1481 and CD1802,3 for MCL and MZL respectively. The simultaneous use of these two markers, together with the CD200 that is positive in most cases of CLL and negative in MCL could be of great interest to better assess the differential diagnosis
Discriminant MFI values of CD148, CD180 and CD200 obtained in the different sets of patients are summarized in table 1. MCL exhibited a strong expression of CD148 combined with a weak expression of CD180 and CD200. A weak expression of CD148 and CD180 coupled to a strong expression of CD200 was typical of the CLL group and a weak expression of CD148 and CD200 coupled to a strong expression of CD180 was observed in the MZL group. A moderate expression of these three markers was observed in the LPL group.
A threshold corresponding to MFI +/- 4 standard error was then calculated for each group, and patients were categorized following the expression profile of these 3 markers (see figures 1 and 2).
In this cohort, the above described profiles correctly identified MCL cases with a specificity of 92% and a sensitivity of 64%, aCLL cases with a specificity of 100% and a sensitivity of 47%, LPL cases with a specificity of 90% and a sensitivity of 54% and MZL cases with a specificity of 99% and a sensitivity of 60%.
These results strongly suggest that the incorporation of these three markers CD148 CD180 and CD200 in addition of the routinely used flow cytometry panel can be helpful in a number of cases for which the diagnosis is difficult
Patients and samples
Blood or bone marrow samples of a well characterized set of patients (N=287) : CLL with a Matutes score > 3 (N=81); MCL harboring t(11;14) translocation or CCND1 overexpression (N=44); LPL (N=58) classified following cytological morphology, IgM peak and the positivity of CD38 and/or Myd88 mutation, MZL (N=84), displaying a CD5- CD23-immunophenotype associated to a splenomegaly and 20 controls.
Immunophenotypic analyses
Flow cytometry analyses have been realized in Nancy and Strasbourg hospitals by combining these three markers: CD148 (Clone 143-41 FITC, R&D system); CD180 (Clone G28.8 PE BD Biosciences) and CD200 (Clone OX104 APC, E Bioscience). . For each group the Median of Fluorescence Intensity and Standard Error have been determined
CONCLUSIONS
REFERENCES
Disclosures: No relevant conflicts of interest to declare Printed by
Table1
Discriminant fluorescence intensity threshold of CD148, CD180 and CD200 in CBCL
CLL MCL MZL LPL CD 148 MFI <690 >980 <1000 540<CD148 MFI<1350 CD 180 MFI <1150 <1500 >2700 500<CD180 MFI<1450 CD 200MFI >500 <900 <2200 <2700 Specificity 100% 92% 99% 90% Sensitivity 47% 64% 60% 54% Figure2
Radar representation of CD148, CD180 and CD200 expression levels on the murge of 10 CLL (purple), 10LPL (blue), 10MCL (red) and 10MZL (green) (Kaluza Analyses 1.3 ©software).
Figure 1
Fluorescence intensity of CD148, CD180 and CD200 in representative cases of CLL, MCL, MZL and LPL using BD FACSDiva© Software
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