Détection des protéines variantes

Afin d’évaluer la capacité à pouvoir détecter des protéines d’abondances significativement différentes entre deux conditions, un test classique de Welch a été appliqué pour les trois comparaisons sélectionnées. Ce test devrait permettre d’évaluer la capacité à identifier l’ensemble des protéines UPS1 variantes connues pour les comparaisons choisies (estimation de la sensibilité) et à estimer les protéines variantes « fausses » de la matrice de levure (spécificité et taux de fausse découverte). Le test pour chacune des trois comparaisons sur les valeurs d’intensités normalisées. Seules les protéines quantifiées dans au moins deux réplicats sur trois ont été prises en compte. Les valeurs d’intensités normalisées ont été transformées en log(2) et les tests ont été réalisés à l’aide du logiciel Perseus.

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La différence d’expression d’une protéine entre les deux conditions d’une comparaison est exprimée par la différence entre les moyennes des intensités de chaque condition transformées en log(2). Une protéine est considérée comme significative si p < 0,05 avec une différence ≥ 1 ou ≤ 1. Une différence ≥ 1 correspond à un ratio de concentration ≥ 2 entre les deux conditions.

Ces résultats ont été représentés sous forme de « volcano plots » pour les trois comparaisons pour chaque protocole : gels stacking (figure 44), tube-gels (figure 45) et digestions liquides (figure 46). Chaque protéine est représentée en selon de sa différence d’expression entre les deux conditions comparées et de la valeur p obtenue par le test de Welch. Les protéines UPS1 apparaissent bien distinctes des protéines de levure avec les trois protocoles. Un chevauchement plus important des ratios de concentration obtenus pour les trois comparaisons est observé pour les digestions liquides.

Figure 44

Représentation de type « volcano plot » obtenue avec les gels stacking. RC : ratio de concentration théorique.

111 Figure 45

Représentation de type « volcano plot » obtenue avec les tube-gels. RC : ratio de concentration théorique.

Figure 46

Représentation de type « volcano plot » obtenue avec les digestions liquides. RC : ratio de concentration théorique.

112

Pour déterminer la sensibilité et la proportion de faux positifs pour chaque protocole, nous avons considéré les protéines comme pouvant être des évènements :

- vrais positifs (VP) : protéines UPS1 déterminées comme variantes avec les critères précédents (p < 0,05 avec une différence ≥ 1)

- faux négatifs : protéines UPS1 déterminées comme non variantes avec les critères précédents (p < 0,05 avec une différence ≥ 1)

- faux positifs (FP) : protéines de levure déterminées comme variantes avec les critères précédents (p < 0,05 avec une différence ≥ 1 ou ≤ 1)

La sensibilité et la proportion de faux positifs peuvent ainsi être définies de la façon suivante :

- sensibilité : VP / (VP + FN). Dans notre cas, la somme VP + FN est égale à 48 car elle correspond au nombre de protéines UPS1 attendues

- Taux de faux positifs : FP / (VP + FP)

Le tableau 19 indique les résultats obtenus pour chaque protocole.

Sensibilité (%) Proportion de faux positifs (%)

Comparaison A Comparaison B Comparaison C Comparaison A Comparaison B Comparaison C Tube-gels 96 96 54 2 0 0 Stacking 92 94 56 2 2 0 Digestions liquides 90 83 40 30 27 0 Tableau 19

Sensibilité et proportion de faux positifs obtenues avec chaque comparaison pour les différents protocoles.

Pour les comparaisons A et B, le protocole TG a permis d’identifier comme variantes les protéines UPS1 avec une sensibilité supérieure aux gels stacking et aux digestions liquides. Pour ces deux comparaisons, la proportion de faux positifs obtenue avec les TG est inférieure ou égale à celle obtenue avec les gels stacking. La digestion liquide donne les moins bons résultats en terme de sensibilité et de proportion de faux positifs dans les deux comparaisons A et B.

Les sensibilités obtenues avec la comparaison C sont inférieures à celles obtenues avec les deux autres comparaisons. Ce point s’explique par l’utilisation d’un ratio seuil de concentration strictement supérieur à deux pour définir une protéine comme variante. Or ce ratio correspond à celui évalué par la comparaison C (10 versus 5 fmol). Les protéines ayant un ratio de concentration calculé strictement inférieur à deux dans la comparaison C n’ont donc pas été considérées comme variantes pour le calcul de la sensibilité.

113 Le protocole TG donne donc des résultats au moins équivalents en termes de sensibilité et de proportion de faux positifs par rapport aux gels stacking. En terme de sensibilité, les moins bons résultats ont été obtenus avec la digestion liquide.

4. C

Ce projet était basé sur la réalisation d’un mélange protéique parfaitement calibré comportant une gamme de concentration de protéines UPS1 dans un lysat protéique total de levure constituant une matrice complexe invariante. Cette stratégie a permis de comparer sur un plan qualitatif (identifications peptidiques et protéiques) et quantitatif (capacités à détecter des protéines variantes) une préparation d’échantillons de type tube-gel par rapport à une préparation 1D SDS-PAGE avec gel stacking ou par rapport à une digestion liquide.

Les résultats démontrent la possibilité d’utiliser ce protocole tube-gel pour l’identification de protéines au sein d’une matrice complexe et la réalisation d’analyses protéomiques différentielles. Ce mode de préparation a pour principaux avantages d’être compatible avec l’utilisation de SDS pour l’extraction et la solubilisation des protéines, et de réduire considérablement le temps de préparation par rapport aux gels d’acrylamide classiques et à la digestion liquide.

Ce mode de préparation tube-gel permet d’envisager plus facilement l’analyse d’un grand nombre d’échantillons compte tenu du gain de temps significatif obtenu lors de la préparation des échantillons.

5. C

Un article soumis à la revue Journal of Proteome Research :

Tube-gel digestion: a fast and reproducible sample preparation protocol for label-free quantitative proteomics of complex biological samples.

L. Muller*, LM. Fornecker*, A. van Dorsselaer, S. Cianferani, C. Carapito. * equally contributed to this work

Une communication par affiche (annexe 6) :

Evaluation de la préparation d’échantillons « tube-gel » pour l’analyse quantitative d’échantillons complexes. L. Muller, LM Fornecker, C. Carapito, S. Cianferani.

Congrès de Spectrométrie de Masse et d’Analyse Protéomique (SMAP) (Ajaccio, 15-18 septembre 2015)

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• Chapitre 5

Recherche de biomarqueurs prédictifs de la réponse au