Méthode de préparation de type « tube-gel »

Cette technique repose sur la polymérisation d’un gel de polyacrylamide directement dans l’échantillon en solution. Elle est réalisée après l’étape d’extraction et de solubilisation des protéines.

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Cette technique présente différents avantages :

- Un gain de temps considérable pour l’analyse d’un grand nombre d’échantillons en raison de l’absence de nécessité de couler un gel au préalable et de réaliser une migration électrophorétique des protéines ;

- Une diminution du nombre d’étapes préparatoires et donc une diminution du risque de perte d’échantillon ;

- La possibilité d’utiliser le SDS comme détergent pour l’extraction et la solubilisation des protéines. Le SDS est retiré après polymérisation du gel par des étapes de nettoyage, de façon équivalente à ce qui est réalisé avec un gel 1D SDS-PAGE classique.

La première description dans la littérature de cette préparation par tube-gel (TG) date de 2005. Elle est apparue comme une technique particulièrement adaptée pour l’analyse des protéines membranaires en raison de sa compatibilité avec divers détergents.121 Par la suite différentes publications ont utilisé cette approche pour l’analyse de protéines membranaires^122–126 ou des radeaux lipidiques.¹²⁷ Dans le cadre de stratégies protéomiques quantitatives, les tube-gels ont été utilisés avec des marquages iTRAQ,¹²² ou sans marquage par comptage de spectres.¹²⁷

L’objectif de ce projet était de comparer ce mode de préparation tube-gel avec les approches conventionnelles reposant sur un gel 1D SDS-PAGE (gel stacking) ou une préparation des échantillons en solution (digestion liquide).

2. P

Une expérience permettant de comparer trois protocoles de préparation des échantillons pour une analyse quantitative « shotgun » a été construite : un protocole de digestion liquide avec une solubilisation des protéines à base d’urée (classiquement utilisé au laboratoire), un protocole de gel stacking et un protocole optimisé de tube-gel. Ces trois modes de préparation ont été comparés en utilisant un mélange protéique standard de référence. Celui-ci est constitué de 48 protéines humaines mélangées en quantité équimolaires (Universal Proteomics Standard, UPS1, Sigma) qui ont été ajoutées dans un lysat total de protéines de levure.

Une gamme comportant six points de concentrations différentes en protéines UPS1 a été réalisée. Les protéines de levure constituent une matrice de fond complexe constante entre chaque point de la gamme. Ces six points de gamme ont été ajustés pour injecter sur le couplage nanoLC-MS/MS des quantités connues de protéines UPS1 : 500 amol, 1 fmol, 2,5 fmol, 5 fmol, 10 fmol et 25 fmol.

97 Cette comparaison des trois protocoles repose sur l’utilisation d’un mélange initial identique de protéines. L’avantage de l’utilisation du SDS pour une meilleure extraction des protéines de levure n’a donc pas été évalué dans cette configuration puisque cette utilisation aurait été incompatible avec le protocole de digestion liquide subséquent. Les protéines de levure ont ainsi été extraites dans un tampon urée (8 M) / bicarbonate d’ammonium (0,1 M).

Pour chaque point de la gamme, le même mélange initial de protéines UPS1 et de protéines de levure a été utilisé pour la réalisation des trois protocoles. Des triplicatas de préparations ont été réalisés pour chaque protocole.

L’utilisation de ce mélange standard de référence commun comportant une gamme de concentration en protéines UPS1 a permis de réaliser une comparaison qualitative et quantitative des 3 protocoles. Les analyses quantitatives ont été réalisées par extraction des courants d’ions MS1. La figure 30 schématise l’ensemble du protocole expérimental mis en place pour ce projet. Les gels 1D SDS-PAGE ont été préparés la veille du dépôt des échantillons.

Figure 30

Schéma de la procédure expérimentale mise en place pour la comparaison des trois protocoles.

Les analyses ont été effectuées sur un instrument de type Q-Exactive Plus (Thermo Fisher Scientific). Les différents points de gamme, préparés en triplicatas pour chaque protocole, ont été injectés de façon aléatoire en monoplicat d’injection. Au total, 54 injections ont donc été réalisées. Les données ont été acquises en mode DDA. Pour chaque analyse MS, les dix ions les plus intenses ont été sélectionnés pour être fragmentés. Le temps d’exclusion dynamique était de 60 secondes. Les paramètres chromatographiques (nanoACQUITY UPLC, Waters) comportaient un gradient de 80 minutes de 1 à 35 % d’acétonitrile.

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Les données de chaque protocole ont été analysées de façon indépendante avec le logiciel MaxQuant70 et son moteur de recherche intégré (Andromeda).68 Les séquences des 48 protéines UPS1 ont été concaténées à la banque Swiss-Prot restreinte à la taxonomie Saccharomyces cerevisiae (7806 entrées à la date du 16 avril 2015). Une recherche en banque target - decoy a été utilisée pour évaluer les taux de faux positifs lors de l’identification. Les intensités normalisées des protéines, générées par le logiciel MaxQuant, ont été utilisées pour la quantification.

Le tableau 16 indique le paramétrage des modifications prises en compte pour l’identification des peptides pour chaque protocole :

Modifications Digestions liquides Gels stacking et Tube-gels

Oxydation (M) Variable Variable

Carbamidométhylation (C) Fixe Variable

Propionamide (C) / Variable

Tableau 16

Paramétrage des modifications fixes et variables pour chaque protocole.

La quantification s’est faite dans tous les cas sur les peptides non modifiés. Les peptides comportant des méthionines oxydées ainsi que leur équivalent non modifié ont été systématiquement exclus de la quantification. La carbamidométhylation des résidus cystéines a été paramétrée en modification fixe dans le cas de la digestion liquide (du fait de l’absence de gel d’acrylamide, les résidus cystéines ne peuvent pas être sujets à une modification propionamide et sont donc considérés comme étant tous carbamydométhylés après l’étape d’alkylation). Les modifications propionamide et carbamidométhylation ont été paramétrées en modifications variables et utilisées pour la quantification dans les deux protocoles basés sur l’utilisation d’un gel de polyacrylamide. Ce paramétrage a permis d’évaluer la proportion de chacune de ces modifications selon le type de gel réalisé. Les résultats ont été validés avec FDR inférieur ou égal à 1 % au niveau peptidique et protéique en utilisant une approche target - decoy.

3. R