2. Identification des ARNm associés à Stau1 pendant la prométaphase
1.9 Le traitement à la CPT inhibe l’effet activateur d’E2F1 sur l’expression de Stau2
Afin de définir l’effet d’un traitement à la CPT sur l’activation de l’expression de Stau2 induite par E2F1, les lignées HA-ER et HA-ER-E2F1 ont d’abord été traitées avec l’OHT pendant 3h avant d’ajouter la CPT, pour une durée totale de traitement de 27h avec l’OHT et de 24h avec la CPT. Par la suite, l’expression de Stau2 a été évaluée tant au niveau de la protéine que de l’ARNm (Fig. 33). Un immunobuvardage de type Western a permis de confirmer les résultats obtenus ci-dessus, selon lesquels l’expression de Stau2 est augmentée lorsqu’E2F1 est suractivée. Il est en effet possible d’observer une augmentation importante de la quantité de tous les isoformes codant pour Stau2 dans la condition HA-ER-E2F1 avec OHT, mais sans CPT (Fig. 33A). Il est d’ailleurs intéressant de noter que la translocation de HA-ER- E2F1 au noyau est en elle-même capable de causer une certaine réponse apoptotique, même en absence apparente d’un stress, ce qui est montré par l’augmentation de PARP1 clivé dans cette condition (Fig. 33A). En ce qui concerne notre préoccupation initiale, nous observons bien une diminution majeure de l’expression de Stau2 dans tous les cas lorsque la CPT est employée, même lorsqu’E2F1 est suractivée. Effectivement, le traitement à la CPT inhibe presque complètement l’augmentation de l’expression de Stau2 engendrée par l’activation d’E2F1 (Fig. 33A).
La figure 33B indique quant à elle que les résultats observés pour l’expression de Stau2 au niveau de la protéine se répètent au niveau de l’ARNm. Ainsi, en présence ou en absence d’OHT, les cellules HCT116 exprimant HA-ER-E2F1 et traitées à la CPT présentent une diminution du niveau d’ARNm codant pour Stau2, diminution comparable à celle qui se produit dans les cellules exprimant le contrôle HA-ER (Fig. 33B). L’expression de l’ARNm codant pour APAF1 a aussi été analysée et bien que ce soit évidemment une augmentation du niveau de cet ARNm qui est observée, la CPT ne semble pas avoir d’effet supplémentaire sur son expression (Fig. 33B). Somme toute, ces résultats indiquent qu’un possible mécanisme de répression de l’expression de Stau2 en présence de dommages à l’ADN réside dans l’inhibition du rôle activateur pouvant être joué par le facteur de transcription E2F1.
Figure 33. L’effet activateur d’E2F1 sur l’expression de Stau2 est inhibé à la suite d’un traitement à la CPT.
A) Les deux lignées de HCT116 exprimant HA-ER (ER) ou HA-ER-E2F1 (E2F1) ont été
aussi avec la CPT (CPT +) ou du DMSO (CPT -) pendant 24h. L’expression de PARP1, de Stau2, d’E2F1 endogène, de HA-ER-E2F1 et de la β-actine, comme contrôle de chargement, a ensuite été analysée par immunobuvardage de type Western avec les anticorps identifiés sur la figure (WB).
B) À partir des échantillons utilisés en A, l’ARN a été isolé et l’expression des ARNm codant
pour Stau2 et APAF1 a été évaluée par RT-qPCR, relativement à l’expression des contrôles β- actine et GAPDH. L’expression de chacun des ARNm pour la condition ER OHT- et CPT- a arbitrairement été définie à 1.
Dans le but de confirmer ces résultats d’une autre façon, les vecteurs pGL3 contrôle et pGL3 Stau2 -195 ont été transfectés dans les lignées HCT116 HA-ER et HA-ER-E2F1 afin d’évaluer l’effet de l’activation de ER-E2F1 par l’OHT et du traitement à la CPT sur l’expression de la luciférase sous le contrôle du promoteur de Stau2 (Fig. 34). Dans le cas des cellules transfectées avec le pGL3 contrôle, les résultats indiquent que le ratio entre l’expression de la luciférase et celle de la YFP ne varie pas entre les différentes conditions, soit en absence ou en présence d’OHT ou de CPT, et ce, que ce soit dans les cellules exprimant HA-ER ou celles exprimant HA-ER-E2F1 (Fig. 34). En ce qui concerne la région active du promoteur putatif de Stau2 (Stau2 -195), nous observons bien une diminution de l’expression de la luciférase dans les cellules HA-ER, traitées ou non avec l’OHT, lors de l’ajout de la CPT (Fig. 34). Le même résultat est obtenu dans les cellules HA-ER-E2F1 non traitées avec l’OHT. Enfin, dans ces mêmes cellules, il est possible de constater une certaine augmentation du ratio d’expression de la luciférase lorsque l’OHT est ajouté. Cette augmentation est alors annulée lorsque les cellules sont en plus traitées avec la CPT (Fig. 34). Ces résultats préliminaires représentent donc une situation similaire à celle observée plus haut, c’est-à-dire qu’E2F1 aurait la capacité d’activer la transcription de Stau2 via certains éléments dans son promoteur, et que la CPT pourrait inhiber cet effet activateur d’E2F1, possiblement en entraînant son déplacement du promoteur, ou d’une autre façon.
Figure 34. L’expression de la luciférase contrôlée par le promoteur de Stau2 est stimulée par l’activation d’E2F1 et la CPT empêche cette stimulation.
Les deux lignées de HCT116 exprimant HA-ER (ER) ou HA-ER-E2F1 (E2F1) ont été transfectées avec le pGL3 contrôle ou le pGL3 Stau2 -195. Elles ont aussi été transfectées avec le vecteur pCMV-Topaz-YFP, comme contrôle de transfection. Cinq heures plus tard, elles ont été traitées avec 500 nM de 4-hydroxytamoxifène (OHT +) ou du DMSO (OHT -) pendant 27h et aussi avec la CPT (CPT +) ou du DMSO (CPT -) pendant 24h. L’expression de la luciférase et de la YFP a alors été détectée et un ratio a été fait entre les deux. Le ratio entre la luciférase et la YFP pour les cellules non traitées (OHT - et CPT -) a arbitrairement été défini à 1.