2. Identification des ARNm associés à Stau1 pendant la prométaphase
1.5 L’expression de Stau2 non régulée par son promoteur natif n’est pas affectée par la CPT
L’obtention des résultats présentés ci-dessus nous a poussés à poser l’hypothèse selon laquelle la diminution de l’expression de Stau2 à la suite d’un traitement avec la CPT se ferait grâce à la modulation de la quantité de son ARNm, donc soit via un contrôle de la transcription du gène, soit via la régulation de la stabilité de l’ARNm. Afin de déterminer quel processus entre les deux est réellement affecté par la drogue, nous avons transfecté les cellules HCT116 avec un vecteur exprimant Stau259-Flag3 (S2F) sous le contrôle d’un promoteur CMV. Ainsi, si l’expression de Stau2 endogène est en fait régulée au niveau de sa transcription, l’absence du promoteur natif dans le cas de S2F devrait permettre son expression normale, même en situation de stress génotoxique. Il faut noter que le cDNA de Stau259 qui a été sous-cloné dans le vecteur d’expression pCMV-Sport contient aussi les séquences 5’UTR et 3’UTR, afin d’exprimer l’ARNm complet de Stau259, les régions responsables de la régulation de la stabilité d’un ARNm se retrouvant souvent dans ces régions non-codantes. Aussi, comme le montre la figure 28, nous avons transfecté seulement une petite quantité du vecteur codant pour S2F (50 ng), afin de limiter son expression à un niveau inférieur à celle de la protéine endogène. De cette façon, nous voulions éviter qu’une surexpression trop grande de S2F entraîne une inhibition du mécanisme responsable de la réduction de la quantité de Stau2 en réponse à des dommages à l’ADN. Ceci explique donc pourquoi nous ne pouvons détecter S2F sur l’immunobuvardage réalisé avec l’anticorps reconnaissant Stau2 présenté à la figure 28A, et que sa détection est très faible sur l’immunobuvardage fait avec l’anticorps reconnaissant l’épitope FLAG. Comme S2F est étiquetée avec 3 peptides FLAG, et non un seul, ceci explique probablement la différence de détection entre les deux immunobuvardages (Fig. 28A).
La figure 28A montre donc que la diminution de l’expression de Stau2 endogène est toujours observée en réponse à la CPT, que ce soit dans les cellules transfectées par le vecteur vide ou par le vecteur codant pour S2F, et ce bien que le niveau d’induction de l’apoptose ne soit pas très important ici si on se fie au taux de clivage de PARP1. Au contraire, aucune réduction de l’expression de S2F n’est observée lorsque la CPT est employée. Pour confirmer cette observation, l’expression de l’ARNm codant pour S2F a aussi été analysée (Fig. 28B). Aucune différence significative de son expression n’est ainsi détectée lorsque des amorces reconnaissant spécifiquement S2F sont utilisées. Cependant, il est toujours possible de remarquer la diminution de l’expression de Stau2 « total », c’est-à-dire des ARNm codant pour Stau2 endogène et pour S2F ensemble, qui sont tous deux reconnus par des amorces s’associant avec la séquence de Stau2 endogène (Fig. 28B).
Figure 28. Lorsque la transcription de Stau2 est sous le contrôle d’un promoteur CMV, la CPT ne régule pas son expression.
A) Des cellules HCT116 ont été transfectées avec pCMV-Sport-Stau259-Flag3 (S2F) ou avec le vecteur vide, puis ont été traitées avec 300 nM de CPT pendant 24h, ou avec du DMSO (- CPT). L’expression de PARP1, de Stau2 endogène, de S2F et de la β-actine, comme contrôle de chargement, a été analysée par immunobuvardage de type Western (WB). Résultat représentatif de trois expériences indépendantes.
B) À partir des mêmes échantillons que pour A, l’expression des ARNm codant pour S2F,
reconnu par des amorces spécifiques, et pour Stau2 endogène a été analysée par RT-qPCR, relativement à l’expression des contrôles β-actine et GAPDH. Stau2 total représente l’expression combinée de S2F et de Stau2 endogène. L’expression de l’ARNm codant pour Stau2 et/ou S2F dans les cellules traitées avec le DMSO a arbitrairement été définie à 1. Les barres d’erreur représentent l’écart-type par rapport à la moyenne de trois expériences indépendantes. **P = 0,01 et ***P < 0,01 comparativement aux échantillons traités avec le DMSO.
Les résultats présentés à la figure 28 nous ont ainsi permis de conclure que l’expression de Stau2 n’est pas régulée au niveau de la stabilité du transcrit et suggèrent qu’elle est plutôt contrôlée, au moins en partie, au niveau de la transcription en réponse aux dommages à l’ADN
causés par la CPT. Étant donné que le promoteur régulant la transcription de Stau2 n’est pas du tout caractérisé, nous nous sommes alors demandé si certains éléments régulateurs présents sur celui-ci sont responsables de l’effet observé, et si des régions particulières du promoteur sont impliquées. Notre étude s’est alors en partie concentrée à tenter de répondre à ces questions.
1.6 L’expression d’un gène rapporteur sous le contrôle du
promoteur putatif de Stau2 peut être modulée par la CPT
L’examen de la région entourant le site d’initiation de la transcription du gène codant pour les différents isoformes de Stau2 a révélé la présence d’une région très riche en GC environ 100 nucléotides en aval de celui-ci, et environ 500 nucléotides en amont (Fig. 29A). Après avoir eu de la difficulté à amplifier et isoler cette région par PCR, en raison de cette région comprenant environ 95% de G et de C, nous avons eu recours à un clone BAC (Bacterial Artificial Chromosome) de séquences génomiques afin d’aller chercher cette région d’intérêt. En fait, à l’aide d’enzymes de restriction, nous avons isolé une région comprenant 4033 paires de bases en amont du site d’initiation de la transcription de Stau2, ainsi que les 197 premières paires de bases en aval de ce site, incluant la séquence complète du premier exon de la plupart des isoformes de Stau2 (Fig. 29A). Cette région a ainsi été sous-clonée en amont de la séquence codant pour le gène rapporteur luciférase dans le vecteur pGL3 (basic), construction que nous avons alors nommée pGL3 Stau2 (Fig. 29A). À partir de cette longue séquence, d’autres digestions enzymatiques ont permis d’obtenir les constructions pGL3 Stau2 -1250 et pGL3 Stau2 -195, celles-ci comprenant des régions beaucoup plus courtes en amont du site d’initiation de la transcription. De la même façon, des délétions plus ou moins longues de séquences incluant la région riche en GC ont été effectuées, afin d’obtenir les constructions pGL3 Stau2 Δ1447 et pGL3 Stau2 Δ860 (Fig. 29A). Afin de vérifier si le promoteur putatif de Stau2 tel qu’identifié permet de réguler l’expression de la luciférase, les constructions présentées à la figure 29A ont été transfectées dans des cellules HEK293T, étant donné que la transfection est plus efficace dans ce type cellulaire par rapport aux HCT116. Un vecteur exprimant la protéine fluorescente YFP a été transfecté de façon conjointe afin que nous puissions contrôler l’efficacité de la transfection.
Comme le montre la figure 29B, le promoteur putatif de Stau2 permet l’expression de la luciférase, lorsque placé en amont de sa région codante. La construction pGL3 Stau2, comprenant la plus longue région du promoteur putatif, semble être moins efficace dans l’induction de la luciférase que les régions plus courtes -1250 et -195, possiblement en raison d’une efficacité moins grande de transfection, étant donné la taille du plasmide, ou encore à cause de la présence d’éléments répresseurs de la transcription. Cependant, l’observation la plus flagrante que nous pouvons faire est que les délétions Δ1447 et Δ860 ne permettent pas du tout l’expression de la luciférase, ce qui indique l’importance de la région riche en GC, et possiblement d’autres éléments activateurs présents dans les régions en amont de la région riche en GC, dans le contrôle de la transcription par le promoteur de Stau2.
Figure 29. La région riche en GC du promoteur putatif de Stau2 assure l’expression de la luciférase.
A) Schéma illustrant la région isolée du promoteur putatif de Stau2. La séquence complète de
4230 paires de bases, isolée à l’aide de digestions enzymatiques d’un clone BAC, a été sous- clonée dans le vecteur pGL3 et a été nommée « Stau2 », tel que présenté dans l’encadré. Les régions « -1250 », « -195 », « Δ1447 » et « Δ860 » ont été obtenues par digestions enzymatiques de « Stau2 ». Nous avions donc les cinq constructions suivantes, pGL3 Stau2, pGL3 Stau2 -1250, pGL3 Stau2 -195, pGL3 Stau2 Δ1447 et pGL3 Stau2 Δ860, qui ont alors été employées dans l’expérience présentée en B. La présence de la région très riche en GC est présentée sur le schéma, alors que le site d’initiation de la transcription est identifié par une flèche.
B) Des cellules HEK293T ont été transfectées avec 1 µg de chacun des vecteurs pGL3
contenant les régions présentées en A, ou avec le vecteur pGL3 basic vide. Elles ont aussi toutes été transfectées avec 1 µg du vecteur pCMV-Topaz-YFP, comme contrôle de transfection. L’expression de la luciférase et de la YFP a été détectée 24h après la transfection et un ratio a été fait entre les deux. Le ratio entre la luciférase et la YFP pour les cellules transfectées avec le vecteur vide a arbitrairement été défini à 1.
Afin de déterminer si le promoteur de Stau2 est sensible à la CPT, les constructions Stau2, -1250 et -195 ont alors été transfectées dans les HCT116, en employant comme contrôle le plasmide pGL3 contrôle, dans lequel l’expression de la luciférase est sous le contrôle du promoteur SV40. Il faut aussi noter que le plasmide pGL3 contrôle permet une expression très forte de la luciférase, alors nous avons dû transfecter une quantité dix fois moins élevée de ce plasmide afin d’obtenir une expression de la luciférase comparable à celle produite par le promoteur de Stau2. Après avoir soumis les cellules transfectées à un traitement avec 300 nM de CPT pendant 24h, le ratio d’expression de la luciférase par rapport à celle de la YFP a été calculé. La figure 30 montre donc que l’expression de la luciférase sous le contrôle du promoteur SV40 n’est pas affectée par le traitement à la CPT. Cependant, la présence du promoteur putatif de Stau2 garantit effectivement une diminution d’expression de
la luciférase à la suite du traitement (Fig. 30). Il est aussi intéressant d’observer que peu importe si 4033, 1250, ou seulement 195 nucléotides sont présents en amont du site d’initiation de Stau2, la diminution d’expression de la luciférase est tout à fait semblable. Cette expérience nous a donc permis d’identifier une région minimale permettant le contrôle de l’expression de Stau2 en réponse à la CPT, c’est-à-dire une région de 392 nucléotides au total, comprenant 195 nucléotides en amont du site d’initiation de la transcription et 197 nucléotides en aval (Fig. 30).
Figure 30. Le promoteur putatif de Stau2 contrôle la diminution de l’expression de la luciférase en réponse à la CPT.
Des cellules HCT116 ont été transfectées avec 100 ng du vecteur pGL3 contrôle ou avec 1 µg des vecteurs pGL3 Stau2, pGL3 Stau2 -1220 ou pGL3 Stau2 -200. Elles ont aussi toutes été transfectées avec 1 µg du vecteur pCMV-Topaz-YFP, comme contrôle de transfection. Cinq heures plus tard, les cellules ont été traitées avec 300 nM de CPT, ou avec du DMSO (NT pour non traitées) pendant 24h. L’expression de la luciférase et de la YFP a alors été détectée et un ratio a été fait entre les deux. Le ratio entre la luciférase et la YFP pour les cellules traitées avec le DMSO (NT) a arbitrairement été défini à 1. Les barres d’erreur représentent l’écart-type par rapport à la moyenne de trois expériences indépendantes. +P < 0,1 et **P=0,01 comparativement aux échantillons traités avec le DMSO.