L’expression de Stau2 est affectée au niveau de la transcription en réponse à la CPT

Après avoir observé la diminution d’expression de Stau2 à la suite du traitement génotoxique, nous nous sommes bien entendu demandé comment cette variation dans la quantité de Stau2 se produisait. Puisque l’expression de l’ARNm codant pour Stau2 diminue de façon considérable en réponse à la CPT (Fig. 25 et 26), nous avons appliqué nos efforts à montrer que c’est l’ARNm qui est affecté. Cependant, nos résultats actuels ne nous permettent pas de mettre de côté la possibilité que la stabilité de la protéine soit aussi modulée à la suite du traitement. Pour évaluer cette possibilité, nous pourrions réaliser une expérience similaire à celle dont les résultats sont présentés à la figure 26, donc en suivant la diminution de l’expression de Stau2 dans le temps à la suite d’un traitement à la CPT, mais en ajoutant en plus du MG132 au préalable afin d’inhiber la dégradation possible de la protéine via le protéasome. Ainsi, si la réduction observée de l’expression de Stau2 est la même avec et sans MG132, nous pourrions conclure que la protéine n’est pas dégradée par le protéasome en réponse à un stress génotoxique et que c’est effectivement seulement l’ARNm qui est touché. Une autre expérience possible consisterait à faire une cinétique après avoir inhibé la traduction dans les cellules HCT116 pour analyser la demi-vie de Stau2 dans ces cellules et la comparer avec la diminution de l’expression de Stau2 après le traitement à la CPT pour observer si le

même résultat est obtenu. Nous pourrions ainsi vérifier si la diminution de la quantité de Stau2 correspond à la demi-vie de la protéine endogène, ce qui signifierait donc que le niveau de la protéine n’est pas dérangé par les dommages à l’ADN.

Étant donné que la quantité d’ARNm stau2 diminue toutefois avant que la quantité de la protéine soit affectée (Fig. 26), nos résultats suggèrent que la modulation de l’expression de Stau2 se produit principalement grâce à un mécanisme régulant l’expression au niveau de l’ARNm. Nous souhaitions alors pouvoir faire la distinction entre un mécanisme de dégradation de l’ARN et un autre ayant plutôt un impact sur la transcription. Pour ce faire, nous avons employé un vecteur permettant l’expression de l’ARNm codant pour l’isoforme de Stau2 de 59 kDa. Évidemment, quatre isoformes de Stau2 existent, mais puisque nos résultats semblent indiquer que l’expression de tous les isoformes est affectée de façon similaire (Fig. 24 et 26), nous avons décidé de nous concentrer sur l’expression d’un seul de ces isoformes. Une expérience intéressante qui pourrait être réalisée serait de concevoir des amorces de qPCR pouvant reconnaître chacun des isoformes individuellement et analyser leur variation en réponse à la CPT. Ceci devrait être possible puisque les ARNm qui codent pour les différents isoformes possèdent certaines régions qui leur sont propres. Pour l’instant, les résultats concernant l’ARNm de Stau2 présentés dans cette thèse ont tous été obtenus grâce à des réactions de qPCR effectuées avec des amorces reconnaissant tous les isoformes de Stau2 en même temps.

Ainsi, nous avons exprimé dans les cellules HCT116 l’ARNm codant pour Stau259, tout en incluant les séquences 5’UTR et 3’UTR, puisque les régions régulant la stabilité d’un ARNm se retrouvent généralement dans ces séquences. La figure 28 montre donc que l’expression de Stau259-FLAG3 (S2F) ne varie pas en réponse à la CPT, ni au niveau de la protéine, ni au niveau de l’ARNm, contrairement à la protéine et à l’ARNm endogènes. Ces résultats suggèrent donc que la stabilité de l’ARNm codant pour Stau2 n’est pas modifiée par le stress génotoxique. Par conséquent, ils indiquent que la présence du promoteur CMV régulant l’expression de S2F n’a pas pu permettre d’observer la diminution de l’expression de Stau2 détectée lorsque c’est son promoteur natif qui la régule. Le seul bémol que nous pourrions apporter est qu’il manque environ le tiers du 5’UTR dans notre construction S2F,

bien qu’il soit de petite taille comparativement à son 3’UTR. Donc si une région régulatrice est présente sur cette séquence, nous n’aurions pas pu évaluer son effet en employant S2F.

Il faut noter que ces résultats ne montrent pas directement l’implication d’un processus d’inhibition de la transcription dans la réduction de l’expression de Stau2, plutôt l’absence de régulation de la stabilité de son ARNm. Notre expérience se compare en fait à une expérience réalisée préalablement pour montrer l’effet de répression transcriptionnelle du gène codant pour Mcl-1, un membre antiapoptotique de la famille Bcl-2, par E2F1 (Croxton et al., 2002). E2F1 peut directement réprimer l’expression de Mcl-1 en réponse à un stress ou lors de sa surexpression, mais, dans ce cas, l’expression de Mcl-1 exogène, stimulée par un promoteur CMV, est tout de même un peu affectée par la surexpression d’E2F1. Ce résultat a donc amené les auteurs à conclure qu’un mécanisme de régulation posttranscriptionnelle pouvait aussi moduler l’expression de Mcl-1, en plus de la répression transcriptionnelle (Croxton et al., 2002). Nos résultats discutés ici, et ceux présentés à partir de la figure 30, semblent plutôt impliquer que la régulation de la transcription de Stau2 constitue l’explication la plus importante de l’effet de la CPT sur son expression.

1.2 Régulation de la transcription de Stau2 en réponse aux