Chapitre 2 : Évaluation des tests de tératogénicité utilisant des embryons de poissons et
2. Analyse séparée des tests
2.1. Test utilisant les embryons de poisson zèbre
L’approvisionnement en œufs de poisson zèbre n’a pas été égal aussi bien en terme de fréquence et de qualité de pontes que de quantités d’œufs par ponte. Au cours de l’étude, l’élevage de poisson zèbre de l’INERIS a perdu ses géniteurs et ne pouvait plus nous fournir en œufs. De plus, le transport des œufs de poisson zèbre entre l’INERIS et Aulnay-sous-bois (45 km) entraînait en moyenne 30 % de mortalité à la réception des pontes. Les œufs de poisson zèbre au stade blastula ayant subi ce transport ont été fragiles à la manipulation ce qui peut biaiser les résultats de l’essai.
Malgré cet aléa, 48 essais sur embryons de poisson zèbre ont tout de même pu être réalisés. Néanmoins, 6 substances de référence n’ont pas pu être testées. De plus, la moitié des substances, soit 17 références, n’a pu être testée qu’une seule fois. Par conséquent, les valeurs de CL50 ou de CE50 de ces substances n’ont pas pu être calculées ou confirmées. Ces valeurs sont signalées par des cellules grisées dans le tableau de résultats (Tableau 34). Pour 10 substances, la concentration la plus haute testée avait moins de 50 % de létalité chez les organismes. Dans ces conditions, aucun test statistique ne peut être appliqué pour calculer la CL50. Par conséquent, 10 valeurs de CL50 ont seulement été estimées supérieures à la concentration maximale testée. De même, 2 valeurs de CE50 ont seulement été estimées inférieures à la concentration la plus basse testée. Dans les deux cas, ceci implique que la valeur de l’IT est au moins supérieure à celle indiquée. Seuls les ITs de 3 substances ont pu être validés et confirmés : pour la colchicine, l’hydroxyzine et l’amarante.
Aucune malformation n’a été observée chez les embryons de poisson zèbre exposés aux 7 références négatives testées, ce qui correspond à des concentrations sans effet reprotoxique observable (NOAEC) de 1 000 mg/L. Le seuil de l’IT peut être fixé à 1,0 pour obtenir 100 % de spécificité. Dans ces conditions, aucune référence négative n’est faussement prédite comme ayant des effets tératogènes, en d’autres termes le test ne présente pas de « Faux positifs ». Ceci implique que si la valeur de l’IT du test utilisant le poisson zèbre est
supérieure à 1,0, la substance peut être considérée comme ayant des effets tératogènes chez le poisson zèbre et comme ayant des effets tératogènes potentiels chez les mammifères. Si la valeur de l’IT est inférieure à 1,0, ce résultat ne constitue par une alerte de tératogénicité pour cette substance dans ces conditions. Ces résultats ne présument en rien de l’innocuité de cette substance pour les mammifères.
Tableau 34 : Résultats du test utilisant les embryons de poisson zèbre
Les valeurs grisées de la colonne CL50 correspondent à la concentration maximale testée en dessous de la CL50 ou à une gamme de concentrations encadrant la CL50. Les valeurs grisées de la colonne CE50 correspondent à la concentration minimale testée au-dessus de la CE50 ou à une gamme de concentrations encadrant la CE50. NR : « Not relevant », les intervalles de confiance n’ont pas pu être établis ou sont non pertinents. Les indices tératogènes grisés indiquent une valeur minimale et qu’un test complémentaire est nécessaire pour déterminer sa valeur exacte, ou que la substance n’a été testée qu’une seule fois. NA : « Non Applicable ». TSK : Trimmed Spearmann-Karber.
Pour l’analyse de la performance d’un test sur un organisme, trois conditions sont analysées. La 1ère condition d’analyse de performance est celle idéale, basée sur les références
Chemical name Nombre total de tests Nombre total de tests valides CL 50 mg / L CL 50 mg / L intervalle de
confiance à 95% Test statistique CE 50 mg / L
CE 50 mg / L intervalle de
confiance à 95% Test statistique IT CL50 / CE50
6-Aminonicotinamide 2 0 >2000 NA NA 290,20 (264,9-316,3) Probit >6,89
Acetohydroxamic acid 1 0 >2000 NA NA <500 NA NA >4
Acetylsalicylic acid 1 1 21,30 (17,1-26,9) Probit 45,80 (28,7-118,2) Probit 0,47
Amantadine 5 1 1240,00 (1020,4-1403,0) Probit 504,21 NR TSK 2,46
Cadmium chloride, 1 0 80,60 (65,3-109,5) Probit <3,1 NA NA >26
Captopril 1 1 >1000 NA NA >1000 NA NA NA Cyclophosphamide C 3 1 784,20 (742,64-828,1) TSK 198,00 NR TSK 8,51 Ethambutol 1 1 >1000 NA NA >1000 NA NA NA Ethylenethiourea 2 0 >10 NA NA 3,15 (2,32-4,51) Probit >3,17 Fluorouracil 3 0 >2000 NA NA 604,00 (541,4-659,6) Probit >3,31 Hydroxyurea 1 0 >2000 NA NA 687,10 (626,2-752,7) Probit >2,91 Isoniazid 1 0 >2000 NA NA 71,16 (40,87-104,89) Probit >28,11
Lithium chloride 2 0 >2000 NA NA 666,08 (499,11-810,64) Probit >3,00
Metoprolol 0 0
bupivacaine hydrochloride 1 1 258,60 (187,7-367,1) Probit 227,90 (190,4-296,5) Probit 1,13
Caffeine 3 0 >250 NA NA 32,30 (30,1-34,6) Probit >7,73
cefuroxime sodium 0 0
Colchicine 3 3 36,00 (30,3-42,9) TSK 24,40 (19,6-30,29) TSK 1,48
Diphenhydramine HCl 0 0
Doxylamine 0 0
Hydroxyzine 4 1 34,87 (26,5-44,3) Probit 11,50 (6,5-16,8) Probit 2,97
Levamisol 1 1 1003,00 NR Probit 382,60 (298,8-578,4) Probit 2,62
Metronidazole 1 0 >2000 NA NA 886,82 (775,33-983,15) Probit >2,26 Pyrilamine 0 0 Saccharin 1 1 >1000 NA NA >1000 NA NA NA Urethane 2 0 >2000 NA NA 956,22 (676,13-1420,43) Probit >25,54 Amaranth 2 1 >1000 NA NA >1000 NA NA NA Ascorbic acid 0 0 Azelaic acid 1 0 100-1000 NA NA 100-1000 NA NA NA Cefotaxime sodique 1 0 100-1000 NA NA 100-1000 NA NA NA Ceftriaxone 1 1 744,00 (429,6-1289,2) TSK - NA NA NA Cromolyn disodique 1 1 >1000 NA NA >1000 NA NA NA Cyclamate sodium 1 1 >1000 NA NA >1000 NA NA NA Lactitol monohydrate 1 1 >1000 NA NA >1000 NA NA NA
les plus fiables. Elle ne prend en compte que les résultats valides et confirmés issus des références positives avec une mention de danger de reprotoxicité réglementaire ainsi que ceux issus des références négatives ne possédant pas d’alerte de tératogénicité dans nos sources d’information. La 2ème condition d’analyse de performance ajoute les résultats des références positives suspectées d’avoir des effets tératogènes de la 2ème catégorie de références. Cette condition permet d’apprécier les capacités du test à détecter des agents tératogènes ayant uniquement des alertes de tératogénicité. Dans le cas particulier du test utilisant le poisson zèbre, une 3ème condition d’analyse est appliquée pour prendre en compte ses résultats dont la majorité ne sont pas valides pour discuter un minimum les capacités globales de ce test (Tableau 35).
Tableau 35 : Évaluation de la concordance du test utilisant les embryons de poisson zèbre selon différentes conditions d’analyse de performance
1ère condition 2ème condition 3ème condition
Nombre de substances de référence 1 3 28
Valeur du seuil de l’IT 1,0
Nombre de « Vrais Positifs » 0 2 17
Nombre de « Faux Négatifs » 0 0 4
Nombre de « Vrais Négatifs » 1 1 7
Nombre de « Faux Positifs » 0
Spécificité 100 %
Sensibilité 0,0 % 100 % 80,0 %
Concordance observée NC 1,00 0,85
Concordance attendue NC 0,55 0,55
Valeur κ NC 1 0,68
Accord de concordance du test NA Parfait Fort
1ère condition : résultats valides et confirmés de la 1ère et de la 3ème catégories de références.
2ème condition : résultats valides et confirmés de toutes les catégories de références.
3ème condition : ensemble des résultats intégrant ceux non valides.
Pour la 1ère condition d’analyse, seulement l’IT de l’amarante est exploitable et le test de concordance n’est pas applicable. Pour la 2ème condition d’analyse, les ITs de la colchicine et de l’hydroxyzine peuvent être aussi intégrés. Le nombre de résultats n’est pas suffisant pour qu’une analyse de ces deux premières conditions d’analyse soit réalisée.
Pour la 3ème condition d’analyse, les ITs de 28 substances de référence ont été estimés ou calculés. Dans ces conditions, le seuil de l’IT peut être fixé à 1,0. Or 17 références positives sur les 21 testées dépassent ce seuil. Par conséquent, le test présente donc 17 VP et 4 FN. Ceci entraîne une sensibilité satisfaisante de 80,0 % avec une bonne concordance observée de 0,85. Dans ces conditions, l’indice Kappa (κ) donne un accord fort au test
utilisant les embryons de poisson zèbre. Ces performances sont celles attendues sur des résultats valides et confirmés, ce qui n’est pas le cas ici. Par conséquent, ces performances ne sont pas exploitables.
Dans nos conditions, un problème d’approvisionnement en œufs de poisson zèbre n’a pas permis de tester les 34 substances de référence et de confirmer la grande majorité des résultats. Seulement 3 références ont des IT valides et confirmés. Ceci ne permet pas d’appliquer un test de concordance à la première et la deuxième condition d’analyse de performance. Si l’on élargit aux résultats non valides obtenus sur 28 références, on obtient une sensibilité satisfaisante de 80 %. Ce nombre est purement indicatif et ne peut être utilisé pour valider le test utilisant les embryons de poisson zèbre. Pour cela, il faudrait poursuivre son évaluation en trouvant une autre source d’approvisionnement en œufs plus fiable pour confirmer les performances satisfaisantes de ce test sur des données validées.
Dans nos conditions, l’organisme poisson zèbre ne semble pas assez robuste pour réaliser un test de criblage.