Test utilisant les embryons de médaka

Remarque : Plusieurs étapes d’optimisation du test utilisant le médaka ont été nécessaires avant d’aboutir à la version présentée dans ce manuscrit. En effet, une durée d’exposition de 13 jours a été testée, ce qui correspond à la limite de la directive 2010/63/UE. Pour des raisons de variabilité interindividuelle, les taux de mortalité étaient faussés et peu reproductibles. La durée d’exposition a ensuite été testée à 8 jours. Mais là aussi pour des raisons de variabilité interindividuelle, l’éclosion sporadique des médakas ne permettait pas d’apprécier les malformations fonctionnelles de la majorité des témoins. Une durée d’exposition de 9 jours est optimale pour s’affranchir des variabilités interindividuelles pour le taux de mortalité et d’éclosion. Cette exposition est également compatible avec des renouvellements de milieux et de lecture pendant des jours ouvrés. La liste de substances de référence a également été testée deux fois avec une durée d’exposition de 13 jours et deux fois avec une durée de 8 jours.

La totalité des substances, soit 34 références, a pu être testée suite à la réalisation de 88 essais (Tableau 36). Toutes les valeurs de l’IT ont pu être confirmées et déterminées sauf pour 3 substances. En effet, les valeurs de la CL50 de l’éthambutol, de l’isoniazide et de la doxylamine sont supérieures à 4 000 mg/L, ce qui est la limite de nos conditions

d’expérimentation. Elles sont signalées par des cellules grisées dans le tableau de résultats. Cependant, plusieurs essais de ces 3 substances ont été réalisés, ce qui a permis d’estimer et de confirmer les valeurs de leur IT supérieures à celles indiquées dans le Tableau 36. Puisque ces 3 valeurs d’IT ont été confirmées, elles sont également prises en compte.

Tableau 36 : Résultats du test utilisant les embryons de médaka

Les valeurs grisées de la colonne CL50 correspondent à la concentration maximale testable dans nos conditions en dessous de la valeur de CL50. Les IT correspondants grisés sont confirmés supérieurs à la valeur indiquée.

NA : « Non Applicable ». TSK : Trimmed Spearmann-Karber.

Parmi les substances de référence négatives, l’acide ascorbique est la seule référence à avoir un IT calculé et confirmé d’une valeur de 2,43. Pour les autres substances négatives, aucune malformation n’a été observée chez les embryons de médaka exposés à la concentration la plus haute testée, ce qui correspond à des NOAEC de 1 000 mg/L.

Chemical name Nombre total de tests Nombre total de tests valides ^{CL 50} mg / L CL 50 mg / L Intervalle de

confiance à 95% ^Test statistique ^{CE 50} mg / L CE50 mg / L Intervalle de

confiance à 95% ^Test statistique IT CL50 / CE50

6-Aminonicotinamide 2 2 2533 (1264,4-26983,31) Probit 36,04 (33,04-39,31) TSK 70,28

Acetohydroxamic acid 2 2 > 1000 NA NA - NA NA NA

Acetylsalicylic acid 2 2 52,24 (44,08-59,59) Probit - NA NA NA

Amantadine 2 1 1161,98 (1093,67-1234,55) TSK 173,98 (157,61-192,05) TSK 6,68 Cadmium chloride, 4 1 22,53 (19,25-26,37) TSK 0,96 (0,81-1,13) TSK 23,47 Captopril 2 2 1364,22 (1034,61-1798,82) TSK 916,95 (613,62-1370,21) TSK 1,49 Cyclophosphamide C 2 2 867,5 (798,27-942,72) TSK 300,12 (267,95-336,16) TSK 2,89 Ethambutol 5 3 > 2000 NA NA 665,53 (520,91-850,07) TSK NA Ethylenethiourea 2 1 125,36 (108,75-144,37) Probit 49,03 (37,65-63,85) TSK 2,56

Fluorouracil 2 2 406,89 (349,39-469,64) Probit 140,9 (131,99-150,15) Probit 2,89

Hydroxyurea 4 1 1157,53 (1040,29-1285,81) Probit 883,96 (834,26-936,62) TSK 1,31

Isoniazid 2 1 >4000 NA NA 1084,45 (1008,50-1166,12) TSK >3,69

Lithium chloride 5 1 1198,487 (1086,14-1473,35) Probit 722,25 (678,27-769,07) TSK 1,66

Metoprolol 2 1 737,9 (696,55-781,70) TSK 597,53 (562,37-634,89) TSK 1,23 bupivacaine hydrochloride 2 2 > 1000 NA NA - NA NA NA Caffeine 2 1 968,75 (875,25-1172,97) Probit 264,84 (228,15-307,44) TSK 3,66 cefuroxime sodium 2 2 > 1000 NA NA - NA NA NA Colchicine 4 2 9,72 (8,01-11,85) Probit 2,62 (2,35-2,91) TSK 3,71 Diphenhydramine HCl 2 1 382,99 (333,46-439,88) TSK 317,14 (155,936-644,90) TSK 1,21 Doxylamine 2 1 >4000 NA NA 255,78 (245,90-266,06) TSK >15,64 Hydroxyzine 2 1 111,96 (93,14-138,32) Probit 57,09 (44,15-73,82) TSK 1,96 Levamisol 4 1 987,13 (819,59-1234,62) Probit 563,71 (446,60-711,53) TSK 1,75 Metronidazole 2 2 > 1000 NA NA - NA NA NA Pyrilamine 2 1 60,46 (50,27-71,19) Probit 52 (46,19-58,54) TSK 1,16 Saccharin 2 2 > 1000 NA NA - NA NA NA Urethane 5 1 3452 (3121-3758) Probit 1080 (940-1250) TSK 3,20 Amaranth 2 2 > 1000 NA NA - NA NA NA

Ascorbic acid 4 2 118,7 (100,51-140,92) Probit 48,76 (38,26-62,13) TSK 2,43

Azelaic acid 3 1 167 (149,8-186,3) TSK - NA NA NA Cefotaxime sodique 2 2 > 1000 NA NA - NA NA NA Ceftriaxone 2 2 > 1000 NA NA - NA NA NA Cromolyn disodique 2 2 > 1000 NA NA - NA NA NA Cyclamate sodium 2 2 > 1000 NA NA - NA NA NA Lactitol monohydrate 2 2 > 1000 NA NA - NA NA NA

Par conséquent, le seuil de l’IT a été fixé à 2,5 pour obtenir 100 % de spécificité pour l’ensemble des conditions d’analyse de performance du test (Tableau 37).

Tableau 37 : Évaluation de la concordance du test utilisant les embryons de médaka selon différentes conditions d’analyse

1ère condition 2ème condition

Nombre de substances de référence 22 34

Valeur du seuil de l’IT 2,5

Nombre de « Vrais Positifs » 8 12

Nombre de « Faux Négatifs » 6 14

Nombre de « Vrais Négatifs » 8 8

Nombre de « Faux Positifs » 0

Spécificité 100 %

Sensibilité 57,1 % 46,1 %

Concordance observée 0,72 0,59

Concordance attendue 0,30 0,42

Valeur κ 0,49 0,29

Accord du test Modéré Faible

1ère condition : résultats valides et confirmés de la 1ère et de la 3ème catégories de références.

2ème condition : résultats valides et confirmés de toutes les catégories de références.

Pour la 1ère condition d’analyse intégrant uniquement les substances avec une mention de danger de reprotoxicité (1ère catégorie de références positives), 22 substances sont prises en compte dont 8 VP, 6 FN et 8 VN. La sensibilité du test est modérée avec 57,1 % avec un accord du test modéré avec l’indice κ.

Pour la 2ème condition d’analyse prenant également en compte les substances avec des alertes de tératogénicité confirmées (1ère et 2ème catégorie de substances de référence positives), 12 substances sont ajoutées aux 22 précédentes. Au total, le test obtient 12 VP, 14 FN et 8 VN. La sensibilité du test est toujours modérée avec 46,1 %. L’accord du test devient faible avec l’indice κ.

Grace à un approvisionnement de qualité d’un laboratoire de recherche, les 34 substances de référence ont pu être testées sur les embryons de médaka avec des résultats valides et confirmés. À cause de valeurs de CL50 supérieures à 4 000mg/L (concentration maximale de nos conditions expérimentales), 3 substances ont des valeurs d’IT estimées mais tout de même confirmées.

Parmi les substances de référence négatives, une seule substance obtient des embryons de médaka avec des malformations. En effet, l’acide ascorbique a une valeur de l’IT égale

à 2,43. Pour satisfaire notre exigence d’obtenir 100% de spécificité, le seuil de l’IT est fixé à 2,5, niveau plus élevé que celui fixé pour le test utilisant les embryons de poisson zèbre.

Dans la 1^ère condition d’analyse de performance du test, la sensibilité obtenue du test est modérée avec 57,1 % ainsi qu’un accord modéré de concordance. Dans la 2^ème condition d’analyse, la sensibilité du test est modérée et diminuée à 46,1 % ainsi qu’un accord faible de concordance.

Dans nos conditions expérimentales, les embryons de médaka sont suffisamment robustes pour réaliser un test de criblage. Par contre, la sensibilité de ce test est modérée avec un seuil fixé à 2,5 pour ne pas détecter l’acide ascorbique comme une substance ayant des effets tératogènes.