Chapitre 2 : Évaluation des tests de tératogénicité utilisant des embryons de poissons et
4. Étude de la spécificité du test utilisant les embryons de médaka
4.2. Résultats obtenus sur l’ensemble des substances de référence négatives
dans le test utilisant les embryons de médaka dans les mêmes conditions que celles décrites précédemment. L’ensemble des résultats obtenus sur les 17 substances de référence de cette liste sont répertoriés dans le Tableau 47.
Tableau 47 : Résultats du test utilisant les embryons de médaka sur les substances de référence négatives
NA : « Non Applicable ». TSK : Trimmed Spearmann-Karber.
Parmi la 4ème catégorie de références, près de la moitié des références soit 4 substances ont obtenu des valeurs d’IT supérieures à 1,0 : l’anthraquinone 2 (1,81), le composé nitré 1 (1,91), le composé phénolique 2 (1,53) et la pyrazolone (1,29) (Figure 54). Ces valeurs d’IT supérieures à 1,0 signifient que quelques malformations ont été observées chez les embryons de médaka à des concentrations sublétales. Parmi la 3ème catégorie de références, l’IT n’a pas pu être déterminé pour 7 substances car aucune malformation n’a été observée chez les embryons de médaka à aucune concentration testée. La dernière substance de cette catégorie, l’acide ascorbique, a obtenu une valeur d’IT égale à 2,4. Il s’agit de la valeur la plus élevée de l’ensemble des références négatives. Par conséquent, le seuil de l’IT reste fixé à 2,5 pour maintenir 100 % de spécificité.
CAS # Chemical name
Nombre total de tests Nombre total de tests valides CL 50 mg / l 9 jours CL 50 mg / l 9 jours Intervalle de
confiance à 95% Test statistique CE 50 mg / l 9 jours CLE50 mg / l 9 jours Intervalle de
confiance à 95% Test statistique IT
915-67-3 Amaranth 2 2 > 1000 NA NA > 1000 NA NA NA
62624-30-0 Ascorbic acid 4 2 118,7 (100,51-140,92) Probit 48,76 (38,26-62,13) TSK 2,43
123-99-9 Azelaic acid 3 1 167 (149,8-186,3) TSK > 1000 NA NA NA 64485-93-4 Cefotaxime sodique 2 2 > 1000 NA NA > 1000 NA NA NA 73384-59-5 Ceftriaxone 2 2 > 1000 NA NA > 1000 NA NA NA 15826-37-6 Cromolyn disodique 2 2 > 1000 NA NA > 1000 NA NA NA 139-05-9 Cyclamate sodium 2 2 > 1000 NA NA > 1000 NA NA NA 81025-04-9 Lactitol monohydrate 2 2 > 1000 NA NA > 1000 NA NA NA
LO1 Anthraquinone 1 2 2 73,8 (40,37-136,41) Probit > 1000 NA NA NA
LO2 Anthraquinone 2 4 1 77,16 (66,14-90,01) TSK 42,61 (37,68-48,18) TSK 1,81
LO3 Composé nitré 1 3 1 163,45 (146,89-182,02) Probit 85,69 (81,57-89,59) Probit 1,91
LO4 Composé nitré 2 2 2 > 1000 NA NA > 1000 NA NA NA
LO5 Composé nitré 3 2 2 > 1000 NA NA > 1000 NA NA NA
LO6 Composé phénolique 1 2 2 > 1000 NA NA > 1000 NA NA NA
LO7 Composé phénolique 2 3 1 997,01 (904,81-1230,85) Probit 650,38 (623,53-677,00) Probit 1,53
LO8 Dérivé d’aniline 2 1 472,59 (369,68-604,14) TSK > 1000 NA NA NA
Figure 54 : Indices tératogènes des 43 références obtenus dans le test utilisant les embryons de médaka
Avec ce seuil, les performances du test ne sont pas modifiées : 57,1 % de sensibilité dans la 1ère condition d’analyse et 46,1 % dans la 2ème condition. Par contre, les contributions des ITs pour les calculs de spécificité et de sensibilité sont plus équilibrées.
Lorsque l’on observe l’ensemble des valeurs de CL50 pour les 43 substances de référence testées sur le médaka (Figure 55), plus de ¾ des substances positives de la 1ère catégorie de références (78,6 %) ont obtenu une valeur de CL50. Un peu plus de la moitié substances positives suspectées d’être tératogènes de la 2ème catégorie de références (58,3 %) ont obtenu une valeur de CL50. Enfin, ¼ des substances négatives de la 3ème catégorie de références (25,0 %) obtiennent une valeur de CL50. Ceci semble indiquer que les substances tératogènes les plus fortes sont les plus létales. Or la valeur la plus faible de CL50 est obtenue avec la colchicine (2ème catégorie de références positives) pour une valeur de 9,72 mg/L. Deux substances de la 1ère catégorie, l’acide acétylsalicylique et le chlorure de cadmium, ainsi qu’une substance de la 3ème catégorie la pyrilamine ont des valeurs de CL50 situées entre 10
et 100 mg/L. A l’inverse, les substances qui ont les plus faibles valeurs de CE50 n’obtiennent pas forcément les valeurs d’IT les plus élevées. Par exemple, la colchicine (2ème catégorie de références positives) obtient « seulement » 3,71 de valeur d’IT avec une valeur de CE50 égale à 2,62 mg/L. Aussi, la doxylamine (2ème catégorie de références positives) a une valeur de CE50 de 255 mg/L pour une valeur de l’IT supérieure à 15,64.
Figure 55 : Représentation graphique des valeurs de CL50 et de CE50 générées sur les 43 références dans le test utilisant les embryons de médaka
Les valeurs de CL50 et de CE50 sont exprimées en log10 et en ordre inversé pour faciliter la lecture et mettre en avant les effets létaux ou tératogènes.
Cette analyse des différentes valeurs de CL50 et de CE50 confirme l’importance d’avoir recours à un indice tératogène faisant le rapport de ces deux valeurs pour mettre en évidence le pouvoir tératogène d’une substance, qui n’est pas forcément lié à une valeur faible de CL50 ou de CE50.
Remarque : Ce test a fait l’objet d’un poster présenté lors du 4th Aquatic Animal Models for Human Disease (Durham, NC / USA) en janvier 2008 (Annexe V). A cette date, le seul critère de catégorisation des substances de référence externes à L’Oréal était la présence ou l’absence d’une mention de danger de reprotoxicité pour l’Homme dans les FDS de 2007. Les références internes sélectionnées par nos toxicologues avaient été alors évaluées non tératogènes par leur soin, sans que des données détaillées soient fournies sur le test. En conséquence, le nombre et la catégorisation des substances de référence divergent entre le poster de 2008 et ce manuscrit. Ces travaux ont également fait l’objet d’un autre poster présenté au 7th World Congress on alternatives and animal use in the life sciences (Rome, Italie) en septembre 2009 (Annexe VI).
L’évaluation du test utilisant les embryons de médaka sur une liste de substances de référence enrichie en substances de référence négatives ayant des données d’absence d’effets tératogènes chez le rat a permis d’apprécier sa capacité à correctement prédire négative une substance de référence négative. Parmi les 9 substances de référence internes à L’Oréal, 4 d’entre elles ont obtenu une valeur de l’IT, ce qui signifie que des malformations ont été observées chez les embryons exposés à ces substances. Ces valeurs se situent entre 1,29 et 1,91 en dessous du seuil de l’IT fixé à 2,5 pour maintenir 100 % de spécificité : toutes les substances de référence négatives sont correctement identifiées comme négatives. Par conséquent, les performances du test ne sont pas modifiées : 57,1 % de sensibilité dans la 1ère condition d’analyse et 46,1 % dans la 2ème condition. Par contre, la contribution des ITs de chaque substance de référence positive ou négative du test est maintenant à peu près équivalente pour le calcul de la spécificité et de la sensibilité du test de tératogénicité utilisant les embryons de médaka.
Dans ces conditions, si une substance testée a une valeur de l’IT supérieure à 2,5, elle sera suspectée d’avoir des effets tératogènes chez au moins une espèce de mammifères et d’obtenir une mention de danger H360D, H360FD, H361d, H361fd ou H410, H411, H412 et H413. Si sa valeur de l’IT est inférieure à 2,5, cela ne préjuge en rien de l’innocuité de la substance pour le développement des mammifères.
Troisième partie : Discussion
Pour déterminer la pertinence d’un test, il faut l’évaluer sur une liste de substances de référence spécifique à l’effet recherché. À cet effet, l’établissement d’une liste de substances tératogènes peut s’avérer ardu étant donné la complexité de l’évaluation de la tératogénicité. L’évaluation du risque d’une substance chimique pour les besoins réglementaires est réalisée sur des organismes modèles mammifères. Cependant, les tests utilisant ces derniers ne sont pas suffisamment prédictifs séparément ou associés pour identifier directement un agent tératogène. C’est le jugement d’expert du toxicologue qui aboutit à une mention de danger pour la reprotoxicité en rassemblant l’ensemble des données disponibles. Par conséquent, des divergences sur ces mentions de danger peuvent exister entre les différentes sources. Pour établir la liste de substances de référence de ce manuscrit, les critères de catégorisation des substances peuvent être discutés. Même une substance tératogène avec des données fiables et reproductibles de tératogénicité peut ne pas être identifiée comme ayant des effets tératogènes chez l’espèce sensible à son effet. En effet, plusieurs paramètres peuvent modifier les résultats de tératogénicité comme les conditions expérimentales, le choix et la mesure des malformations à identifier ou encore la méthode d’interprétation des effets tératogènes.
Les résultats de ce manuscrit montrent que le test de tératogénicité sur les embryons de médaka est pertinent et fiable pour l’évaluation des agents tératogènes. Les conditions fixées permettent d’identifier correctement et avec certitude un agent tératogène sur deux sur la base de la liste de substances de référence évaluées. Ce test peut être considéré comme un nouveau test d’écotoxicité aquatique chronique et un test de criblage alternatif à l’expérimentation animale.
Cependant les mesures d’effets de ce test pourraient être quantifiées et de manière automatisée pour les rendre objectifs et reproductibles dans n’importe quel laboratoire. Cette automatisation pourrait permettre d’ajouter de nouveaux paramètres d’effets et augmenter la sensibilité du test sans augmenter le coût ou la durée du test. Une fois le test optimisé, ses performances pourraient être à nouveau évaluées sur une liste élargie de substances de référence pour obtenir une meilleure représentativité des agents tératogènes. Le champ d’application du test pourrait être élargi à d’autres aspects de la reprotoxicité. Certaines perturbations endocriniennes de l’axe stéroïde sexuel (axes œstrogénique et androgénique) pourraient être intégrées par le recours à une lignée transgénique avec des
marqueurs fluorescents pour mettre en évidence des évènements clés menant à des altérations de la fertilité. Le test de tératogénicité utilisant les embryons de médaka reste un test de criblage d’exclusion et il doit être associé à d’autres outils pour procéder à l’évaluation non réglementaire de la tératogénicité voire de la reprotoxicité.