Test des micronoyaux

Ce test n’a pas été présenté dans le chapitre 2 puisqu’il a été difficile à mettre au point sur les lignées commerciales et que l’optimisation sur les kératinocytes primaires n’a pas été réussie. Il s’agit d’un test de génotoxicité mettant en évidence des cassures ou pertes de chromosomes induits par des agents génotoxiques après division cellulaire. Il se forme alors des micronoyaux dans le cytoplasme des cellules en interphase. Le protocole, adapté d’une ligne directrice de l’OCDE [4], consiste à ensemencer des cellules à faible densité dans des plaques 96 puits noires à fond plat et transparent. Pour les cellules pulmonaires A549, la densité d’ensemencement est de 5 000 cellules/puits, pour les cellules intestinales HCT116, elle est de 2 500 cellules/puits et de 10 000 cellules/puits pour les kératinocytes. Après 24 h, les différentes expositions sont réalisées puis les cellules incubées 24 h supplémentaires à 37 °C et 5 % de CO2. Le contrôle positif utilisé peut être spécifique du type de lésion (aneugène, en cas de pertes de chromosomes ou clastogène en cas de cassures de chromosomes). Pour cette expérience, l’agent clastogène Mitomycine C est utilisé à 25 et 50 ng/mL pour tenir lieu de contrôle positif. A T = 48 h, un blocage de la cytokinèse est réalisé en exposant les cellules à 4 µg/mL de cytochalasine B durant 24 h. A T = 72 h, les cellules sont rincées avec du PBS puis fixées avec de la PFA 4 % pendant 15 min à température ambiante. Les cellules sont ensuite colorées au Hoechst 33342 pendant 15 min puis rincées au PBS et stockées dans du PBS avec 50 % de glycérol. Après avoir optimisé les paramètres de lecture afin que l’appareil détecte les bons objets, les plaques sont analysées par le CellInsight qui détecte, dans les cellules binucléées, la présence de micronoyaux (Figure 40). Les cellules binucléées possédant des micronoyaux sont tout d’abord recherchées par le CellInsight. Elles sont entourées en bleu foncé si elles sont validées ou en orange si elles sont rejetées par l’appareil (Figure 40B). Puis, dans une aire définie autour de ces cellules binucléées (grand cercle vert, Figure 40B), la présence de micronoyaux est recherchée (petit cercle bleu clair, Figure 40B). L’optimisation des paramètres consiste à trouver le meilleur compromis pour détecter le maximum de cellules binucléées et de micronoyaux, tout en limitant les erreurs de comptage. Les résultats obtenus sont donc le taux de cellules binucléées dans les champs analysés, le taux de cellules binucléées présentant au moins un micronoyau parmi toutes les cellules binucléées (sans prendre en compte le nombre de micronoyaux dans les cellules binucléée), ainsi que l’indice de prolifération qui détermine le nombre de divisions effectuées par les cellules pendant la période d’exposition à la cytochalasine B. Des difficultés ont été rencontrées avec les cellules HCT116 puisqu’elles adhèrent moins bien au support que les cellules A549 et se décrochent au cours des différents

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traitements. Pour pallier ce problème, la référence des plaques a été changée et l’étape de rinçage avant la fixation des cellules a été supprimée. La concentration en Mitomycine C est également plus élevée pour cette lignée (100 et 500 ng/mL). En ce qui concerne les kératinocytes primaires, plusieurs expériences ont été réalisées sans succès (pas de cellule binucléée). Le temps de doublement de ces cellules étant plus élevé que pour les autres lignées, des incubations plus longues (jusqu’à 48 h) avec la cytochalasine B ont été testées sans succès. Cette méthode n’a donc pas été utilisée avec les QDs.

Figure 40 : Observation des cellules binucléées possédant des micronoyaux en A, ainsi que les paramètres de détection par le CellInsight en B.

Criblage à haut débit sur les nanomatériaux issus du projet SafeTiPaint :

Etant donné que l’objet principale de l’étude est la toxicité des QDs sur les kératinocytes primaires et que les cellules binucléées n’ont pas été obtenues sur ce modèle, toutes les expériences de criblage des micronoyaux n’ont pas été menées. La Figure 41 présente une série de résultats obtenus sur la lignée cellulaire A549. Ces résultats concernent les slurries de peintures présentées dans l’introduction du chapitre. Pour le test, ces échantillons sont dilués à 50 µg/mL dans du milieu de culture puis les cellules y sont exposées pendant 24 h. Après analyse par le CellInsight, les données sont regroupées puis synthétisées dans la Figure 41. Dans un premier temps, il faut s’assurer que le nombre de cellules binucléées soit suffisant pour l’analyse. Suivant les recommandations OCDE, ce nombre doit être au minimum de 2 000 cellules par condition (à répartir entre les réplicats et les expériences réalisées indépendamment). Généralement au laboratoire, les expériences sont réalisées trois fois indépendamment avec cinq réplicats par expérience. Mis à part le contrôle positif Mitomycine C (MMC c) qui est cytotoxique, la Figure 41A montre un taux d’environ 50 % de cellules binucléées par condition sur 2 500 cellules comptées, soit plus de 1 000 cellules binucléées par condition pour chaque expérience, ce qui est suffisant pour l’analyse. Il est

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également nécessaire d’évaluer la prolifération cellulaire afin de s’assurer que les cellules se soient bien divisées de la même manière dans toutes les conditions durant l’exposition à la cytochalasine B. Pour cela, l’effet cytostatique est mesuré à l’aide de l’indice de prolifération (CBPI pour cytokinesis-block proliferation index) sur le CellInsight. Cette valeur correspond au nombre moyen de noyaux par cellule. Un résultat de 1 signifie que toutes les cellules sont mononuclées (cytostase de 100 %) et plus le résultat est proche de 2, plus le nombre de cellules binucléées est important (cellules ayant subi une division au cours du blocage de la cytokinèse). Dans la Figure 41B, l’IP est d’environ 1,7-1,8 pour les différentes conditions, ce qui est correct. Le contrôle positif MMC c est nettement inférieur (1,2), ce qui est justifié par le fait que ce composé soit cytotoxique et donc qu’il augmente l’effet cytostatique des cellules. Finalement, les résultats obtenus dans la Figure 41C ne montrent pas d’augmentation du taux de cellules binucléées traitées ayant des micronoyaux en comparaison avec le contrôle (CTL). Ainsi, aucune lésion chromosomique n’est mise en évidence après exposition aux différents échantillons de peintures.

Figure 41 : Test des micronoyaux après exposition des cellules A549 pendant 24 h à des slurries de peintures à base de TiO2. La Mitomycine C à 50 ng/mL est utilisée comme contrôle positif. Le taux de cellules binucléées est mesuré en A, l’indice de prolifération en B et le taux de cellules binucléées avec présence de micronoyaux en C.

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