Evaluation de la cytotoxicité

4.1.1. Mesure de l’activité métabolique : test WST-1

Le test WST-1 est choisi car les tests réalisés montrent que ce réactif n’interfère pas avec les QDs. Les résultats seront présentés dans le chapitre 5. Il s’agit d’un test colorimétrique qui permet d’évaluer la viabilité cellulaire. Son principe repose sur le sel de tétrazolium WST-1 (4-[3-(4-iodophenyl)-2-(4-nitrophenyl)-2H-5-tetrazolio]-1,3-benzene disulfonate), que les déshydrogénases cellulaires réduisent en formazan avec pour conséquence un changement de couleur. Plus précisément, cette réaction fait intervenir la succinate désydrogénase, spécifique de la chaine respiratoire mitochondriale, qui est active dans les cellules dont le métabolisme est intact. Une mesure d’absorbance à 450 nm permet alors de quantifier le formazan dont la

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concentration est proportionnelle à l’activité mitochondriale et, par extension, à la viabilité cellulaire.

Ainsi, après avoir ensemencé des plaques 96 puits, les cellules sont exposées aux différentes suspensions de QDs pendant 24 h. Le contrôle positif utilisé est une solution de nanoparticules de polystyrène dont la surface est fonctionnalisée par des amines (PSNH2, Sigma-Aldrich) à 100 µg/mL, dont la cytotoxicité est avérée [10]. A la suite de cette exposition, les QDs sont retirés et les cellules sont rincées avec du PBS, puis 100 µL de WST-1 (Roche), au 1/10^ème dans du milieu de culture non supplémenté, sont ajoutés dans chaque puit. Les plaques sont ensuite placées dans l’incubateur à 37 °C pendant 1 h 30, puis l’absorbance est mesurée à 450 nm et 650 nm avec un spectrofluorimètre (Spectramax M2, Molecular Device). Pour l’analyse, l’absorbance à 650 nm, reflétant le bruit de fond de la mesure, est soustraite à celle à 450 nm.

Les expériences sont réalisées au moins trois fois indépendamment avec des cellules de donneurs différents (une expérience par donneur) et, pour chacune de ces expériences, cinq réplicats par condition sont réalisés. Pour évaluer l’interférence optique des QDs avec le test, après exposition au WST-1, les plaques sont centrifugées pendant 5 min à 50 × g, puis le surnageant est transféré dans une nouvelle plaque 96 puits et l’absorbance est mesurée et comparée à celle obtenue sans l’étape de centrifugation. Si les absorbances sont comparables, alors les QDs n’interfèrent pas dans la lecture. En revanche, si les QDs interfèrent, les absorbances mesurées dans les deux conditions seront différentes. Dans un deuxième temps, pour vérifier qu’il n’y ait pas d’interférence chimique entre le réactif et les QDs, un autre test est réalisé en mélangeant la solution de WST-1 avec les plus fortes concentrations en QDs dans des puits sans cellule. Si la solution ne se colore pas, c’est qu’il n’y a pas d’interférence entre les composés. En revanche, si la solution se colore en l’absence de cellules, cela signifie que les solutions de QDs réagissent avec le WST-1.

4.1.2. Mesure de l’intégrité membranaire : test LDH

De la même manière que pour le WST-1, le test d’activité de la LDH (Lactate déshydrogénase) est sélectionné car il ne présente pas d’interférence avec les QDs (cf. chapitre 5). Il s’agit également d’un test colorimétrique qui permet d’évaluer la viabilité cellulaire par le biais de la mesure de l’intégrité membranaire, qui est un autre paramètre affecté lorsque la viabilité cellulaire diminue. L’emploi de ces deux tests complémentaires permet d’assurer la robustesse des conclusions. La LDH est une oxydoréductase intracellulaire qui catalyse

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l’oxydation du lactate en pyruvate en réagissant avec NAD+ et inversement, qui réduit le pyruvate en lactate grâce à NADH. Lorsque la membrane des cellules est lésée, elle devient perméable et libère les LDH dans le milieu environnant. Le principe de ce test est de quantifier les LDH libérées dans le milieu après exposition à des agents toxiques. Pour cela, du NAD⁺ (dans le kit Sigma-Aldrich il s’agit du « co-facteur ») est ajouté et converti en NADH à l’aide d’agents de transferts d’électrons (dans le kit Sigma-Aldrich, il s’agit du « tampon »). Le NADH formé catalyse alors l’oxydation des sels de tétrazolium présents dans le mélange réactionnel (dans le kit Sigma-Aldrich, il s’agit du « substrat ») en formazan, ce qui permet d’obtenir une solution qui absorbe à 490 nm.

Pour cela, après avoir ensemencées et exposées les cellules de la même façon que pour le test WST-1 (avec le même contrôle positif), 50 µL de surnageant sont prélevés de chaque puits et transférés dans une nouvelle plaque 96 puits. Un volume de 100 µL d’un mélange de réactifs composé, à volume équivalent, de substrat, de co-facteur et de tampon (LDH assay kit, Sigma-Aldrich) est ajouté à chaque surnageant. Les plaques sont incubées pendant 30 min à température ambiante à l’abri de la lumière, puis la réaction est stoppée par ajout de 10 µL d’acide chlorhydrique (HCl, 1 M) par puits. L’absorbance est mesurée à 490 nm et 690 nm sur le Spectramax M2 utilisé également pour le WST-1, puis l’absorbance à 690 nm est soustraite à celle à 490 nm. Ces expériences sont également réalisées au moins trois fois indépendamment avec des cellules de donneurs différents et, pour chacune de ces expériences, cinq réplicats par condition sont réalisés. L’ajout du mélange réactionnel dans des puits remplis de QDs dilués dans du milieu de culture aux plus fortes concentrations permet de vérifier que les QDs n’interfèrent pas dans la réaction chimique du test LDH. En effet, comme décrit précédemment pour le WST-1, l’absence de coloration dans ces contrôles traduit une absence d’interférence entre les réactifs et les QDs.

4.1.3. Comptage des noyaux : marquage Hoechst 33342

Un des objectifs de ce travail a été de mettre en place des méthodes de criblage à haut débit des effets toxiques des QDs. Dans ce cadre, nous avons souhaité développer un test évaluant la cytotoxicité des QDs qui puisse être couplé au test de génotoxicité par comptage automatique des foci de 53BP1 (cf. partie 4.2.2), c’est-à-dire, qui puisse être réalisé en parallèle à ce test, sur la même plaque de cellules. Or, la coloration des noyaux des cellules par marquage de l’acide désoxyribonucléique (ADN) au Hoechst 33342 est réalisée pour le test 53BP1. Il permet également d’évaluer le nombre de noyaux cellulaires encore présents après exposition aux QDs, et, en le comparant au nombre de noyaux dans les puits de cellules non exposées, il

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permet donc d’avoir une mesure de la cytotoxicité des QDs. Lors de l’immunomarquage 53BP1 (cf. partie 4.2.2), les cellules sont marquées avec du Hoechst 33342 (Sigma-Aldrich) à 0,3 µg/mL pendant 20 min, puis rincées au PBS et stockées dans du PBS contenant 50 % de glycérol. Le nombre de noyaux présents dans chaque puits est alors décompté grâce au microscope automatique de la plateforme de criblage à haut contenu (CellInsight CX5, Thermo Fisher Scientific). Les spectres d’excitation et d’émission (Exmax = 340 nm et Emmax = 460 nm) du Hoechst 33342 ne se recouvrent pas avec ceux des QDs (Exmax = 380 nm et Emmax = 550 nm), les interférences de mesures sont donc peu probables. En effet, aucune interférence n’a été observée avec le microscope automatisé. Ces expériences ont été réalisées deux fois indépendamment sur des kératinocytes de donneurs différents, avec 5 réplicats par condition pour chaque expérience.