Modèles cellulaires

3.1. Les kératinocytes primaires humains mammaires (HKPM)

Isolement des HKPM de l’épiderme

Les cellules utilisées sont isolées à partir d’explants chirurgicaux de peaux provenant de restrictions mammaires de donneuses saines, grâce à une collaboration avec le Centre Hospitalier Universitaire (CHU) de Grenoble. Ces prélèvements ainsi que les expériences effectuées sont en accord avec les directives et règlementations en vigueur, notamment les articles L1245-2 et L1211-2 sur le consentement obligatoire des donneurs et l'utilisation des déchets chirurgicaux à des fins scientifiques (Loi n° 2004-800 du 6 août 2004 relative à la

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bioéthique). Pour limiter la variabilité interindividuelle, les biopsies sont sélectionnées en fonction de l’âge et du phototype des donneurs. Le profil des donneurs sélectionnés correspond dans le cas de cette thèse à des femmes jeunes (entre 15 et 30 ans), car leurs cellules se divisent plus vite et possèdent peu de dommages liés au vieillissement de la peau. Les phototypes I et II sur l’échelle de Fitzpatrick sont sélectionnés, les peaux claires étant plus fines et donc potentiellement plus sensibles aux agents toxiques.

La méthode d’isolement des HKPM s’inspire de protocoles recensés dans la littérature [7], [8]. Ainsi, la biopsie de peau est récupérée et traitée dans les heures qui suivent l’opération si celle-ci a lieu le matin. Lorsque l’opération a lieu en fin de journée, la peau est conservée à 4 °C et traitée le lendemain matin. Elle est tout d’abord désinfectée par immersion dans du PBS contenant 0,4 % de Bétadine pendant 15 min à température ambiante, puis transférée dans du PBS contenant 10 % d’antibiotiques (pénicilline à 5 000 U/ml et streptomycine à 5 000 µg/mL, Thermo Fisher Scientific). L’excès de graisse est enlevé à l’aide d’un scalpel puis la peau est découpée en petits morceaux et placée dans une solution de dispase à 10 mg/mL (Thermo Fisher Scientific) pendant 3 h à 37 °C ou sur la nuit à 4 °C. Après cette incubation, l’épiderme se détache facilement du derme. Il est donc récolté à l’aide de pinces puis déposé dans un tube rempli de 15 mL de trypsine-EDTA (0,5 g/L trypsine, 0,2 g/L EDTA, Thermo Fisher Scientific). Ce tube est placé au bain marie à 37 °C et vortexé toutes les 2 min pendant 6 min afin de dissocier les différents éléments de l’épiderme. Les cellules sont alors filtrées à travers un tamis cellulaire de 70 µm puis l’action de la trypsine est stoppée par ajout de PBS contenant 10 % de sérum de veau fœtal (SVF). Afin de retirer la trypsine, le tube est centrifugé pendant 10 min à 470 × g. Le surnageant est retiré puis le culot cellulaire est remis en suspension dans un milieu sélectif, le K-SFM pour keratinocytes serum free medium, supplémenté de 0,9 ng/mL de facteur de croissance épidermique (EGF) et de 25 μg/mL d’extrait hypophysaire bovin (BPE) (kit 17005075, Thermo Fisher Scientific). Par ailleurs, le milieu de culture est également supplémenté avec 50 μg/mL de Primocin (50 mg/mL, InvivoGen). Il s’agit d’un agent antimicrobien spécifique aux culture primaires, actif contre les bactéries, les champignons et les mycoplasmes. Le milieu K-SFM supplémenté, comme décrit ci-dessus, sera également appelé « milieu complet » dans la suite du manuscrit. Les cellules sont transférées dans des flasques de 175 cm² (Falcon) à une densité d’environ 5 x 106 cellules dans 30 mL de milieu. Les cellules sont cultivées dans un incubateur à 37 °C en atmosphère humide avec 5 % de CO2. Leur milieu est changé tous les 2-3 jours jusqu’à ce qu’elles atteignent une confluence d’environ 70-80 % (la vitesse de prolifération dépend du donneur).

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Congélation et décongélation des HKPM

Lorsque les HKPM arrivent à confluence, le milieu de culture est retiré et les cellules sont rincées à l’aide de PBS. Les cellules sont ensuite décollées des flasques par ajout de 4 mL de trypsine-EDTA par flasque, et placées dans l’incubateur pendant 10 min. La trypsine est ensuite inactivée par 6 mL de PBS contenant 10 % de SVF puis les cellules sont comptées. Après centrifugation pendant 7 min à 470 × g, les culots sont repris dans le milieu de congélation (SVF contenant 10 % de diméthylsulfoxyde (DMSO)) à une densité de 2 x 10⁶ cellules par mL. Ils sont ensuite congelés dans des cryotubes (1 mL/tube) et placés dans des boites de congélation pour cryoconservation pendant 24 h à -80 °C avant d’être stockés directement dans l’azote liquide. Pour la décongélation, les tubes sont plongés quelques minutes dans le bain marie à 37 °C puis dilués dans du K-SFM complet. Après centrifugation (7 min à 470 × g), le milieu de congélation est retiré et les cellules sont mises en suspension dans du K-SFM complet puis ensemencées à 2 x 106 de cellules par flasques de 75 cm2 dans un volume total de 15 mL/flasque.

Culture des HKPM

Les cellules sont cultivées dans des flasques de 75 cm² (Falcon) avec du milieu K-SFM complet. Le milieu est changé trois fois par semaine (tous les 2-3 jours). Lorsqu’elles atteignent 70-80 % de confluence, elles subissent un passage. Comme pour la congélation, elles sont décollées du support à l’aide de 2 mL de trypsine-EDTA par flasque puis placées dans l’incubateur pendant 7 à 10 min. Après ajout de 8 mL de PBS contenant 10 % de SVF pour inactiver la trypsine, elles sont centrifugées (7 min à 470 × g), puis reprisent dans du K-SFM complet. Ensuite elles sont comptées à l’aide d’un compteur automatique après marquage au bleu de trypan pour vérifier leur viabilité, puis réensemencées à 1,5 x 10⁶ cellules par flasque. Le temps entre deux passages varie en fonction des donneurs et les cellules ne sont utilisées que lors des trois premiers passages.

Pour les différentes expériences, les HKPM sont ensemencés à environ 60 000 cellules/cm² (plus ou moins selon la vitesse de division cellulaire des donneurs) dans les supports appropriés tels que les flasques de 75 cm² et des plaques multi-puits (12 ou 96 puits, Falcon) ainsi que des lames en verre dotées de 4 chambres de culture (LAB-TEK). Seules les expériences de criblage à haut contenu par microscopie automatisée (HCS ou HCA) qui nécessitent un faible ensemencement cellulaire, sont ensemencées à environ 30 000 cellules/cm2 dans des plaques 96 puits noires à fond plat, fin et transparent (Falcon 353219).

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Test des mycoplasmes

La méthode de détection des mycoplasmes utilisée est la coloration au 4',6-diamidino-2-phénylindole (DAPI) [9]. Elle est effectuée sur les HKPM de chaque donneur après décongélation. Pour cela, les cellules sont ensemencées à faible densité (30 000 cellules/cm²) dans une boite de Petri de 11,7 cm² où ont été déposées au préalable deux lamelles de microscopie en verre. Les cellules sont ensuite fixées deux jours plus tard pendant 20 min dans une solution de paraformaldéhyde (PFA) à 4 % dans du PBS, rincées avec du PBS puis colorées à l’aide de DAPI (4',6-diamidino-2-phénylindole) à 1 µg/mL (dans du PBS), pendant 15 min. Après de nouveaux rinçages au PBS, les lamelles sont retirées de la boite et montées sur des lames de microscopie standard à l’aide d’une goutte de milieu de montage (Mowiol, Sigma-Aldrich). L’observation est ensuite réalisée sur un microscope à épifluorescence (Axio Imager A1, Zeiss). Les HKPM utilisés pour ces travaux n’ont pas présenté de contamination.

3.2. Les modalités d’expositions des HKPM aux QDs

Après transfert en solution aqueuse par échange de ligand, les QDs sont en solution dans du PBS à une concentration de l’ordre de quelques µM. Pour l’exposition des HKPM, les QDs sont dilués dans le milieu K-SFM complet, à des concentrations finales allant de 3,125 nM à 100 nM, puis déposés sur les cellules, qui sont exposées généralement pendant 24 h (Figure 30).

Figure 30 : Protocole d’exposition des HKPM aux QDs.

3.3. L’observation des HKPM en MET-EDX

Des cellules exposées aux QDs (vieillis et non vieillis) ainsi que des cellules non traitées ont été observées en MET pour mettre en évidence l’accumulation et la répartition intracellulaire des QDs. Ces expériences ont été réalisées sur la plateforme MET de l’Institut de Biologie Structurale (IBS, Grenoble) en collaboration avec Benoit Gallet et Christine

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Moriscot. Les cellules (HKPM 144) sont ensemencées dans des chambres de culture sur lame en verre (LAB-TEK 4 chambres) à une densité de 120 000 cellules par chambre puis exposées aux QDs 24 h plus tard. Après 24 h d’exposition aux différents QDs, les cellules sont rincées avec du tampon PHEM 0,1 M à pH 7 composé de PIPES 30 mM, HEPES 12,5 mM, MgCl2 5 mM et EGTA 1 mM. Elles sont ensuite fixées pendant 30 min à température ambiante avec 4 % de PFA et 0,4 % de glutaraldéhyde préparé dans du PHEM 0,2 M auquel a été ajouté du milieu de culture (v/v). La fixation se poursuit pendant 30 min supplémentaires à température ambiante dans 2 % de PFA et 0,2 % de glutaraldéhyde dans 0,1 M de PHEM. Les cellules sont ensuite rincées trois fois dans 0,1 M de PHEM et sont post-fixées dans 1 % de tétroxyde d'osmium (OsO4) et 1,5 % de ferrocyanure de potassium (K3Fe(CN)6)dans du tampon PHEM 0,1 M pendant 1 h à température ambiante. Ces étapes sont suivies de 3 rinçages à l'eau, puis d’une coloration des échantillons avec 0,5 % d'acétate d'uranyle dans 30 % d'éthanol pendant 30 minutes à température ambiante, à l’abri de la lumière. Les cellules fixées et colorées sont ensuite déshydratées dans un gradient d’éthanol puis imprégnées de résine EPONTM. Des coupes ultrafines sont alors réalisées (80 nm) à l’aide de l’ultra-microtome Leica UC7 et collectées sur grilles de cuivre recouvertes de Formvar carbone. Les coupes sont observées, par Christine Moriscot, sur un MET (Tecnai G2 Spirit BioTwin (FEI) équipé d’une caméra CCD ORIUS SC1000 (Gatan)), fonctionnant à 120 kV. L’analyse EDX de ces coupes est réalisée en collaboration avec Pierre-Henry Jouneau sur le microscope précèdemment décrit dans ce chapitre (cf. partie 2.5).