Immunomarquage 53BP1

Pour rappel, ce test permet de marquer la protéine 53BP1 qui fait partie du complexe de réparation des cassures double-brin de l’ADN, recrutée directement sur le site de lésion (cf. chapitre 2). L’ensemencement des cellules est réalisé de la même manière que pour le marquage Hoechst 33342 puisque ce marquage est aussi effectué 48 h après l’ensemencement des cellules. La détection des foci de 53BP1 dans les noyaux des cellules par le CellInsight est illustrée dans la Figure 36. Les noyaux marqués au Hoechst 33342 (en bleu sur les photos), servent d’objets principaux pour la détection des foci. Ils sont entourés en vert s’ils sont validés, ou en orange s’ils sont rejetés par l’appareil, en fonction des paramètres sélectionnés comme la taille et la forme des noyaux (Figure 36B). Ensuite, au sein de noyaux validés, la présence de foci de 53BP1 est recherchée (spot vert, Figure 36A), et validée (en rouge, Figure 36B) s’ils correspondent aux paramètres enregistrés. Les paramètres de détection des foci sont optimisés en fonction de leur taille, leur forme et leur intensité de fluorescence. Pour l’analyse, l’appareil fait la moyenne du nombre de foci détectés par noyau.

Figure 36 : Observation des foci de 53BP1 dans les noyaux des cellules en A, ainsi que les paramètres de détection par le CellInsight en B.

147

La première étape d’optimisation de ce test fût de mettre au point les bonnes concentrations d’anticorps primaire (Ac I) et secondaire (Ac II) pour obtenir un marquage suffisamment intense mais sans bruit de fond. Pour l’Ac II (Anti Rabbit IgG Atto 488, Sigma-Aldrich), la dilution testée puis validée est de 1/2 000. En revanche, les dilutions testées pour l’Ac I (Rabbit TP53BP1, Abnova) spécifique de la protéine 53BP1, sont de 1/500, 1/1 000 et 1/2 000. Une condition supplémentaire sans Ac I est réalisée pour tester la spécificité de l’Ac II sur ce dernier, afin de s’assurer qu’il ne se fixe que sur l’Ac I. Les résultats de ces expériences sont synthétisés dans la Figure 37. Les différentes dilutions en Ac I testées fonctionnent toutes et les images obtenues par le microscope sont similaires, avec peu de bruit de fond (Figure

37 A-C). Dans une optique d’utilisation raisonnable du produit, la dilution retenue pour l’Ac I est de 1/1 000. De plus, l’absence de foci dans la condition où l’Ac I n’a pas été ajouté prouve que l’Ac II fluorescent ne se fixe que sur l’Ac I (photo en haut à gauche de la Figure 37 et graph C).

Figure 37 : Optimisation de la dilution de l’Ac I pour la mise au point du test 53BP1 en HCS sur des cellules A549. Marquages fluorescents permettant le décompte du nombre de noyaux via le marquage Hoechst 33342 (noyaux en bleu sur les photos de la figure A, quantifiés dans le graph B), ainsi que le nombre de foci moyen par noyau via l’immunomarquage 53BP1 (spots en vert sur les photos de la figure A, quantifiés dans le graph C).

Une fois ces tests mis au point, les essais sur les QDs ont révélé une interférence de fluorescence avec l’Ac II. L’anticorps a donc été remplacé par un autre, similaire mais couplé à un fluorochrome émettant dans le rouge profond (Anti Rabbit IgG Atto 633, Sigma-Aldrich). La dilution utilisée est la même que précédemment, à savoir 1/1 000. Les résultats sont présentés dans le chapitre 5.

0 1 2 3 4 0 1/500 1/1000 1/2000 No m b re m o ye n d e foc i p ar n o ya u Dilutions de l‘Ac I

B

A

C

148

Criblage à haut débit sur les nanomatériaux issus du projet SafeTiPaint :

Les résultats obtenus après optimisation de la méthode sont présentés dans la Figure 38. Ces résultats concernent les peintures vieillies présentées dans l’introduction du chapitre. Après réception de ces échantillons, les poudres sont dispersées dans de l’eau puis diluées dans le milieu de culture des cellules pulmonaires A549, avant d’exposer ces dernières durant 24 h à 50 µg/mL. Cette concentration a été choisie arbitrairement après qu’aucune cytotoxicité n’ait été mise en évidence sur une gamme de concentration allant de 6,25 à 100 µg/mL (Figure 39). Les concentrations plus élevées n’ont pas été testées pour éviter toute interférence entre les particules de titane et les tests biologiques [1]. Par ailleurs, un contrôle positif nanoparticulaire a été recherché. Or, il a été rapporté que l’oxyde de cobalt (CoO3) et l’oxyde de nikel (NiO) à l’état nanoparticulaire ont des propriétés génotoxiques [2], [3]. Dans cette expérience, l’oxyde de nickel cobalt (CoNiO2) nanoparticulaire a été testé à 10 et 50 µg/mL (après avoir vérifié la cytotoxicité pour ces concentrations). Ce composé génère bien des cassures de l’ADN (Figure

38A) avec un effet plus marqué à 50 µg/mL. Cependant, l’effet reste beaucoup plus marqué avec l’étoposide à 100 µM. De plus, cet effet est retrouvé chez les cellules intestinales HCT116 exposées à 20 µg/mL, mais pas chez les kératinocytes primaires à 50 µg/mL. Donc, pour plus d’homogénéité entre les tests et dans le cadre de cette thèse reposant principalement sur les kératinocytes primaires, l’étoposide à 100 µM est conservé puisqu’il est un bon contrôle positif sur les trois lignées. Il est important de noter que les contrôles positifs étant cytotoxiques, ils entrainent généralement une diminution du nombre de noyaux dans les puits (Figure 38C). Il s’agit donc de trouver le bon compromis entre la concentration générant le plus de lésions et la concentration induisant le moins de cytotoxicité possible. Pour les différentes peintures, les résultats montrent que le nombre de noyaux dans les puits reste stable après exposition aux différents résidus (Figure 38D) et qu’aucune augmentation significative du nombre de cassures double-brin n’est observée après 24 h d’exposition (Figure 38B) en comparaison au contrôle dont la valeur est en moyenne de 0,09 foci par noyau (Figure 38A). En conclusion de ces résultats, les résidus d’abrasion de peintures ne semblent pas engendrer de cytotoxicité ni de génotoxicité.

149

Figure 38 : Evaluation des cassures double-brin de l’ADN après exposition des cellules A549 pendant 24 h à des résidus d’abrasion de peintures non vieillies (0 h) ou préalablement vieillies en enceinte climatique pendant 500 h et 1000 h. Ces résultats sont issus de la méthode d’un immunomarquage 53BP1 (A-B) associée au décompte des noyaux par marquage au Hoechst 33342 (C-D). L’étoposide à 100 µM et l’oxyde de nickel cobalt (CoNiO2) à 10 et 50 µg/mL sont utilisés comme contrôle positif. PC500, PEG, CNC correspondent respectivement aux peintures avec le TiO2 seul, fonctionnalisé en surface avec du polyéthylène glycol ou greffé sur des nanocristaux de cellulose.

Figure 39 : Evaluation de la cytotoxicité des résidus de peintures non vieillis ou préalablement vieillis en enceinte climatique pendant 500 h et 1 000 h après exposition des cellules A549 pendant 24 h. Ces résultats sont issus du test colorimétrique WST-1 et PSNH2 à 100 µg/mL est utilisé comme contrôle positif. Pour des raisons de clarté, ce contrôle n’est pas représenté sur la figure mais entraine une mortalité cellulaire d’environ 70 %.

150