Techniques de physiologie cellulaire

Efflux d’iodure

Il s’agit d’une technique qui permet d’étudier la fonctionnalité des canaux chlorures dans une population cellulaire. Elle repose sur la mesure du changement de concentration en radiotraceur de part et d’autre de la membrane cellulaire. L’iodure radioactif 125I présente de nombreux avantages qui font de lui le traceur idéal pour l’étude de l’activité des canaux chlorure, comparé au chlore radioactif ³⁶Cl^-. En effet, la plupart de ces canaux présentent une sélectivité pour l’iodure et pour les ions chlorure. De plus, l’125I présente une durée de vie qui est beaucoup plus faible que celle du ³⁶Cl^- (60 jours contre 300 000 ans) et son utilisation est beaucoup moins coûteuse (environ 10 fois moins chère).

2- Protocole

La technique est effectuée par le docteur Caroline NOREZ. Elle est réalisée sur des cellules cultivées jusqu’à 100% de confluence dans une plaque 24 puits selon le protocole suivant :

- Rincer les cellules avec le milieu d’efflux (Tableau 15) puis déposer un milieu dit « de charge », composé de milieu d’efflux complémenté par 1 µCi/ml de ¹²⁵INa (NEN Life Sciences).

Tableau 15 : Composition du milieu d’efflux utilisé.

- Laisser incuber pendant 1 heure à 37°C, afin de permettre à l’iode radioactif de s’équilibrer de part et d’autre de la membrane cellulaire.

Milieu d’efflux NaCl 136.9 mM KCl 5.4 mM CaCl2 1.8 mM MgCl2 0.8 mM NaHCO3 4.2 mM NaH2PO4 0.3 mM KH2PO4 0.3 mM MgSO4 0.4 mM HEPES 10 mM D-glucose 5.6 mM pH 7.5

94 - A l’issus de cette incubation, les étapes qui suivent sont à réaliser par le robot

MultiPROBE II (Packard).

- Rincer les cellules avec le milieu d’efflux afin d’éliminer l’iodure non incorporé, puis déposer 500 µl de ce milieu.

- Une minute après, collecter le milieu dans un tube à hémolyse et déposer un volume équivalent de milieu « propre ».

- Répéter cette dernière étape encore 8 fois :

o Les 3 premiers tubes à collecter correspondent à l’efflux basal de l’iode radioactif sortit de la cellule de manière passive.

o Les 6 autres prélèvements correspondent aux milieux collecté après l’addition d’agents pharmacologiques : pour notre étude, il s’agit d’un cocktail activateur de CFTR composé de 10 µM de forskoline (Fsk), un activateur d’adénylate cyclase et 30 µM de génistéine (Gst), qui active directement le CFTR).

- A la 10ème minute, incuber les cellules pendant 30 minutes en présence d’une solution de lyse composée de 0,1% SDS et 0,1 M NaOH afin de récupérer et d’évaluer la radioactivité résiduelle des cellules (restes).

- Mesurer la radioactivité contenue dans les tubes collectés ainsi que dans le lysat (restes) à l’aide d’un compteur gamma (Cobra II, Packard) en coups par minute (cpm).

3- Analyse des résultats

Les résultats en cpm obtenus par le compteur sont présentés sous la forme de vitesse de sortit d’iodure radioactif (k) par minute (k (min-1)) (Figure 35) grâce à la formule suivante : k = [In(125I t1) - In(125I t2))] / (t1-t2). Les 125I t1 et 125I t2 correspondent à la radioactivité (cpm) mesurée à temps t1 et t2 respectivement. Les résultats présentés en histogrammes sont représentés en kpeak-kbasal afin de s’affranchir de la sortie passive de l’iodure radioactif.

Figure 35 : Exemple de représentation graphique des résultats d’efflux d’iodures.

kbasal

kpeak

95

Fiche technique N°11 :

Etude des variations du potentiel membranaire avec la sonde oxonol

La Sonde Oxonol ou bis-(1,3-diethylthiobarbituric acid) trimethine oxonol (DiSBAC2(3) Molecular Probes, Eugene, OR) est un fluorochrome hydrophobe anionique avec les longueurs d’ondes d’excitation et d’émission de 546 nm et 580 nm respectivement (Figure 36). L’oxonol est sensible aux variations du potentiel de membrane. En présence des cellules dépolarisées, la sonde traverse leur membrane et se lie aux protéines membranaires intracellulaires. Ainsi, l’accumulation d’oxonol dans la cellule au cours de sa dépolarisation se traduit par une augmentation de la fluorescence émise. A l’inverse, la diminution de la quantité d’oxonol dans la cellule lors de l’hyperpolarisation provoque une diminution de la fluorescence émise. Il est donc possible d’explorer l’état d’activation d’un canal ionique en suivant les changements du potentiel de membrane cellulaire, induits par le mouvement des ions du canal étudié. Dans le cas du canal CFTR, une augmentation de la fluorescence suite à son activation sera associée à une dépolarisation de la cellule, induite par la sortie d’ions chlorure par CFTR. Ainsi, la quantité de fluorescence émise est proportionnelle à l’activité de CFTR.

Figure 36 : Structure de la sonde oxonol [DiSBAC2(3)].

2- Protocole

La mesure de fluorescence est effectuée à température ambiante à l’aide d’une station de microscope inversé ZEISS Axio observer ZI, et l’acquisition des signaux et le traitement des images est opéré grâce au module Physiology du logiciel Carl Zeiss AxioVision Release 4.8.2. La technique est réalisée sur des cellules cultivées dans des boites à fond verre jusqu’à environ 100% de confluence selon le protocole suivant :

96 Tableau 16 : Composition de la solution Krebs sans Cl-.

- Incuber les cellules pendant 20 minutes à température ambiante et à l’obscurité avec 250 nM d’oxonol, dilué dans la solution de Krebs dépourvue de Cl-.

- Déposer la boite de cellules sur le microscope et choisir une zone du tapis cellulaire = zone de travail.

- Prendre une photo de la zone afin d’avoir une référence correspondante à l’intensité de la fluorescence basale (F0) de chaque pixel de la zone.

- Sélectionner (grâce aux outils du logiciel) 10 à 12 cellules de cette zone afin de suivre et d’enregistrer les variations de fluorescence de leur sonde avant et après ajout d’agents pharmacologiques. Ici, il s’agit du cocktail activateur de CFTR (forskoline 10 µM + génistéine 30 µM) et l’inhibiteur sélectif de CFTR (CFTRinh172).

- Appliquer une excitation par une lampe fluorescente à 546 nm toutes les 30 secondes (durant 800 ms). À chaque exposition une photo F(t) est prise. Les variations de fluorescence sont retransmises sous la forme intensité de fluorescence en fonction du temps.

3- Analyse des résultats

Les résultats obtenus sont présentés en pourcentage de variation de fluorescence (Fx) selon l’équation suivante : Fx = ([Ft – F0] / F0) x 100. Les Ft et F0 correspondent à l’intensité de fluorescence au temps t et t0 respectivement (Figure 37).

0 2 4 6 8 10 -2 0 2 4 6 8 10 12 Activateur Inhibiteur Temps (min) [(F t -F 0 )/ F⁰ ]* 1 0 0

Figure 37 : Exemple de représentation graphique de la fluorescence de la sonde oxonol.

Solution de Krebs dépourvue de Cl

-Na-gluconate 101 mM K-acetate 5 mM Ca-gluconate 2 mM Mg-acetate 2 mM Mannitol 50 mM Glucose 5 mM pH 7.4

97

Fiche technique N°12 :

Chambre de Ussing

La chambre de Ussing est une technique in vitro et ex vivo, qui permet d’étudier le transport des électrolytes, des éléments nutritifs et de drogues à travers les tissus épithéliaux. Elle représente donc un bon outil dans les domaines de physiologie et de pharmacologie. Son principe repose sur la propriété d’étanchéité de l’épithélium, ainsi que sur la distribution asymétrique des protéines de transport entre le côté apical et basolatéral des cellules. Le mouvement d’ions se produisant au travers d’une membrane confère à la cellule une polarité qui se traduit par la ddp (différence de potentiel). L’amplitude de courant électrique annulant cette ddp (0 mV) appelé courant de court-circuit Isc (short circuit current) traduit donc le mouvement d’ions se produisant au travers de l’épithélium étudié (Figure 38).

Figure 38 : Principe de la technique de chambre de Ussing.

2- Préparation des cellules

L’expérimentation est réalisée sur des cellules cultivées sur des inserts de type Transwell 6 puits (Transwell® permeable Supports, Corning). Chaque insert est formé d’une membrane microporeuse sur laquelle les cellules vont pouvoir se multiplier pour atteindre la confluence et former une monocouche de cellules, délimitant un pôle apical et un pôle basal « pseudo-épithélium ». Grâce à la configuration suspendue des inserts, il est possible de cultiver les cellules en interface air/liquide (coté apical des cellules en contact de l’air environnant, et coté basal en contact du milieu du puits) permettant ainsi de reproduire l’épithélium bronchique.

98 L’intégrité de l’épithélium peut être vérifiée en mesurant la résistance électrique transépithéliale (Rte). En effet, la Rte augmente avec le temps de la culture jusqu’à atteindre un maximum, puis commence à décroitre.

Dans notre étude, les cellules sont ensemencées à raison de 500 000 cellules/insert et sont cultivées en condition air/liquide jusqu’à avoir une résistance de 500 Ω/cm² (environ 10 jours de culture). Les inserts utilisés sont formés d’une membrane en polycarbonate de 12 mm et constituée de pore de 0.4 μm (Corning Costar Snapwell™, Sigma). La faible taille des pores permet d’éviter la colonisation de la face basale de la membrane par les cellules.

3- Système expérimental et protocole utilisé dans le laboratoire

Le système utilisé dans notre laboratoire (Easymount, EM-CSYS-6, Physiologic Instruments) est composé de 6 chambres en plexiglas constituées chacunes de deux hémi-chambres indépendantes. Chaque insert contenant la culture cellulaire est monté entre deux hémi-chambres qui peuvent contenir la même solution expérimentale ou deux solutions différentes. Afin de garder les tissus étudiés en conditions physiologiques tout au long des expérimentations, le système est relié à un bain-marie, qui permet de maintenir les solutions des hémi-chambres à 37°C. Il est également relié à une bouteille de gaz contenant un mélange de 95% d’O2 et 5% de CO2, afin de créer un système de bullage qui sert à l’oxygénation des tissus et à la circulation des solutions.

Les paramètres électriques du tissu sont déterminés grâce à deux couples d’électrodes (constituées d’agar 4% et KCl 3M) situées chacun de part et d’autre de l’insert : (i) le couple d’électrodes de voltage, placé au plus près de l’insert, permet de mesurer la différence de potentiel (ddp) du tissu en cours d’étude et (ii) le couple d’électrodes de courant, placé plus loin de l’insert, permet de déterminer le courant de court-circuit Isc. La technique de « voltage clamp » a été utilisée afin de déterminer ce courant Isc. Le tissu est « court-circuité » par l’injection d’un courant imposant une ddp de 0 mV au tissu. La valeur de ce courant correspond au courant de court-circuit (Figure 39).

99 Figure 39 : Chambre de Ussing.

Les électrodes sont reliées à un préamplificateur, lui-même relié au VCC MC2 (multichannel voltage-current clamp, Physiologic Instruments), un système composé d’un amplificateur, un millivoltmètre, un générateur de courant et un microampèremètre. L’amplificateur est relié à son tour à un ordinateur par le biais d’une interface d'acquisition de données (DI-720-P, Physiologic Instruments) permettant de transformer les informations électriques ou analogique reçues de l’amplificateur en données numériques enregistrées grâce au logiciel “Acquire & Analyse 2.3”.

4- Protocole

- Equilibrer les électrodes :

o Monter un insert vide sans cellules entre les deux hémi-chambres remplies de la solution apicale et basale (Tableau 17).

Solution de Krebs « normale »

NaCl 107 mM KCl 5 mM CaCl2 1.2 mM MgSO4 1.2 mM NaH2PO4 0.2 mM Na2HPO4 1.8 mM NaHCO3 25 mM Glucose 12 mM pH 7.4

Tableau 17 : Composition de la solution de Krebs « normale ».

100 - Monter l’insert contenant les cellules polarisées et attendre quelques minutes pour que

les échanges et donc le courant de court-circuit basal soit stable.

- Injecter un courant d’une valeur déterminée et non nulle (ici, +2 mV) afin de déterminer la résistance transépithéliale (Rte) du tissus, grâce à l’équation d’Ohm : Rte(Ω)=ΔU(mV)/ΔIsc(µA).

- Clamper les cellules afin de maintenir une ddp de 0 mV et commencer l’enregistrement des courants résultants avant et après ajout d’agents pharmacologiques. Ici, il s’agit du cocktail activateur de CFTR (forskoline 10 µM + génistéine 30 µM) et l’inhibiteur sélectif de CFTR (CFTRinh172).

101

Résultats

I. Les protéines EDEMs comme cibles thérapeutiques dans la