D. F508del-CFTR et la réponse UPR
I. Matériel cellulaire
Fiche technique N°1 :
Lignées cellulaires, culture et entretien
Les différentes lignées cellulaires sont manipulées en conditions stériles sous une hotte à flux laminaire verticale. Elles sont maintenues et cultivées à 37°C sous une atmosphère humide composée de 5% de CO2 et 95% d’O2.
1- Culture des lignées cellulaires
a) Lignées Hela WT- et F508del-CFTR
La cellule Hela est une lignée cellulaire humaine immortelle issue d’un adénocarcinome du col utérin de la jeune femme Henrietta Lacks. N’exprimant pas la protéine CFTR, cette lignée a été stablement transfectée avec un plasmide codant la protéine CFTR sauvage (WT-CFTR) ou mutée (F508del-(WT-CFTR). Le plasmide porte également un gène de résistance à la zéocin. Les lignées sont mises en culture dans le milieu de culture décrit dans le tableau 2 :
Milieu de culture pour cellules Hela WT- et F508del-CFTR
Milieu DMEM - Dulbecco's Modified Eagle Medium (Gibco) 500 ml Sérum de veau fœtal (SVF) (Fisher Scientific) 10%
Pénicilline (Sigma Aldrich) 100 U/ml
Streptomycine (Sigma Aldrich) 100 µg/ml
Agent de pression de sélection : Zéocin (Invitrogen) 125 mg/ml Tableau 2 : Composition du milieu de culture pour les lignées cellulaires Hela WT- et
F508del- CFTR.
b) Lignée CFBE41o-
Il s’agit d’une lignée cellulaire épithéliale bronchique homozygote pour la mutation F508del-CFTR. Elle a été mise au point par l’équipe du Professeur Gruenert pour étudier le canal CFTR (Cozens et al., 1994). Cette lignée a la capacité de former une monocouche polarisée lorsqu’elle est cultivée in vitro en condition air/liquide. Le milieu de culture utilisé pour cette lignée est décrit dans le tableau 3 :
75
Milieu de culture pour cellules CFBE41o-
Milieu MEM Eagle with Earle's BSS, without L-glutamine (Lonza) 500 ml
Sérum de veau fœtal (SVF) (Fisher Scientific) 10%
L-Glutamine (Sigma) 2 mM
Plasmocyne (Invitrogen) 5 µg/ml
Tableau 3 : Composition du milieu de culture pour la lignée cellulaire CFBE41o-.
2- Entretien des lignées cellulaires
Lorsque les cellules atteignent environ 80% de confluence, elles sont réensemencées dans une nouvelle flasque de culture appelée flasque « de routine » et si nécessaire, également dans des supports adaptés aux manipulations envisagées. Ce repiquage s’effectue une seule fois par semaine pour tout type cellulaire, selon le protocole suivant :
- Rincer les cellules avec une solution PBS (Phosphate Buffer Saline) dépourvue de calcium et magnésium (Lonza).
- Répartir sur le tapis cellulaire la trypsine (T4049, Sigma) à raison de 1 ml/25 cm2 et placer dans l’incubateur (37°C) durant 1 minute pour les lignées Hela WT- ou F508del-CFTR et 4 minutes pour la lignée CFBE41o-.
- Une fois les cellules décrochées de leur support, stopper l’action de la trypsine en ajoutant 5 ml de milieu de culture.
- Finir le décollement des cellules en effectuant des aspirations et des refoulements du milieu puis, transférer la totalité des cellules dans un tube contenant 30 ml de milieu de culture.
- Centrifuger pendant 7 minutes à 1100 rpm puis éliminer le surnageant. - Remettre en suspension le culot cellulaire dans 1 ml de milieu de culture.
- Après avoir complété avec 5 ml de milieu de culture supplémentaire, dénombrer les cellules puis les ensemencer à la dilution souhaitée sur les supports adéquats et selon le type d’expériences envisagées.
- Tous les 2 jours, aspirer le milieu des cellules et le remplacer par du milieu frais afin de renouveler les nutriments.
76
Fiche technique N°2 :
Congélation et décongélation des lignées cellulaires
1- La congélation
Il est possible de constituer un stock des différentes lignées cellulaires pour toute utilisation ultérieure en les congelant dans de l’azote liquide à -180°C. Le protocole suivi pour la congélation des cellules utilisées dans cette étude est le suivant :
- Décrocher les cellules de leur support par de la trypsine puis les centrifuger comme indiqué en fiche technique N°1.
- Resuspendre le culot cellulaire obtenu dans un milieu de congélation qui correspond à du milieu de culture supplémenté avec 10% de DMSO (DiMéthylSulfOxyde), un agent cryoprotecteur qui permet d’empêcher la formation de cristaux.
- Transférer de manière très rapide les cellules dans des cryotubes. - Congeler pendant 24 heures à -80°C.
- Le lendemain, stocker les cellules dans de l’azote liquide (-196°C).
2- La décongélation
La décongélation des cellules doit se faire de manière très rapide afin que les cellules restent le moins longtemps possible en contact avec le DMSO, toxique à température ambiante. Le protocole suivi est le suivant :
- Plonger le cryotube dans un bain marie (37°C) le temps de décoller le « glaçon » de cellules de la paroi du cryotube.
- Transvaser le « glaçon » de cellules dans environ 35 ml de milieu de culture afin de bien diluer le DMSO.
- Centrifuger l’ensemble à 1100 rpm pendant 7 minutes.
- Remettre en suspension le culot cellulaire obtenu dans 6 ml de milieu de culture. - Ensemencer la totalité des cellules dans une flasque de culture de 25 cm2 (T25) puis la
placer dans l’incubateur.
77
Fiche technique N°3 :
Isolement des cellules épithéliales bronchiques des patients CF
1- Origine des prélèvements
Les fragments de tissus pulmonaires mucoviscidosiques sont fournis par le service de chirurgie cardiothoracique de l’hôpital FOCH de Suresnes lors d’une transplantation pulmonaire sur des patients mucoviscidosiques (collaboration avec le Docteur Bonnette). Une fois prélevés, les fragments sont conservés à 4°C dans une solution dite de « décontamination CF » (Tableau 4) jusqu’au moment de la dissection.
Milieu de décontamination CF Milieu DMEM-HAM F12 500 ml Pénicilline-streptomycine 1 mg/ml Amphotéricine B 100 µg/ml Gentamicine 0.5 mg/ml Ceftazidine 500 µg/ml Ticarcilline 500 µg/ml
Tableau 4 : Composition du milieu de décontamination pour échantillons CF.
Durant ces 3 années de thèse, nous n’avons malheureusement reçu que deux prélèvements provenant de 2 patients hommes (29 et 35 ans), homozygotes pour la mutation F508del-CFTR. La récupération de ces prélèvements est conforme à la législation française et approuvée par le comité de protection de personne OUESTIII.
2- Dissection et isolement des cellules épithéliales bronchiques :
Une fois arrivés au laboratoire, les fragments pulmonaires sont rapidement disséqués et les cellules épithéliales bronchiques sont isolées selon le protocole suivant :
- La manipulation doit être effectuée sous une hôte à flux laminaire.
- Mettre le prélèvement pulmonaire reçu dans une boîte contenant le milieu de décontamination CF.
- A l’aide des ciseaux de microdissection, dissocier les bronches et bronchioles du parenchyme puis les transférer dans une boîte propre contenant du PBS (Lonza) froid. - Ouvrir les bronches et bronchioles dans leur longueur puis effectuer trois bains
78 - A l’aide d’une pince courbe, gratter la surface interne de chaque bronche/bronchiole
afin de décoller l’épithélium puis transférer l’ensemble dans un tube de 50 ml.
- Centrifuger à 2 000 rpm pendant 6 minutes puis remettre le culot cellulaire délicatement en suspension avec 1 ml de milieu de culture primaire CF (Tableau 5).
Milieu de culture primaire CF
Milieu DMEM-HAM F12 500 ml Pénicilline-streptomycine 1 mg/ml Tobramycine 500 µg/ml Ceftazidine 500 µg/ml Transferrine 7.5 µg/ml Insuline 5 µg/ml EGCS 2 µg/ml T3 0.03 µg/ml EGF 2.5 ng/ml L-Glutamine 1 µM Hydrocortisone 1 µM
Tableau 5 : Composition du milieu de culture primaire CF.
- Dénombrer les cellules épithéliales sur cellule de Malassez puis les ensemencer sur les supports adéquats pour les manipulations envisagées.
- Incuber les cellules à 37°C sous une atmosphère humide composée de 5% de CO2 et 95% d’O2 jusqu’au moment de leur manipulation.
79