Nous avons mis en évidence dans cette partie de l’étude, l’implication de l’α1,2-mannosidase I du RE (ERManI) dans la rétention réticulaire de F508del-CFTR. Son extinction partielle par son siRNA spécifique a été associée avec une restauration de la fonction CFTR-dépendante. Comme pour le traitement au trivalent-DMJ, ERManI knockdown restaure F508del-CFTR à la membrane cellulaire sous sa forme immature (bande B). Plusieurs études décrivent ERManI comme le « minuteur » qui déclenche la première étape de la voie de dégradation en clivant le premier résidu mannose de la branche B de l’oligosaccharide (Araki and Nagata, 2011; Caramelo and Parodi, 2015; Zhou et al., 2015). Ainsi, l’absence de restauration de la forme mature de F508del-CFTR pourrait être expliquée par le fait que l’extinction d’ERManI par siRNA empêcherait la génération du motif oligosaccharidique de forme M8GlcNAc2 de F508del-CFTR et favoriserait ainsi son transport vers l’appareil de Golgi avec le motif M9GlcNAc2, gênant le processus de maturation (Figure 61). En effet, après le cycle de calnexine/calréticuline, les glycoprotéines natives ou mal repliées subissent par l’enzyme ERManI un clivage du résidu mannose de la branche B de leur motif M9GlcNAc2
pour générer le motif M8GlcNAc2. Les glycoprotéines mal repliées subissent d’autres clivages de mannose qui les envoient vers la dégradation ; au contraire, les glycoprotéines natives transitent vers l’appareil de Golgi (Figure 61).
167 Figure 61 : Devenir des glycoprotéines correctement- ou mal-repliées.
L’oligosaccharide Glc3Man9GlcNAc2 : carrés bleu : N-acétylglucosamine, cercles vert : mannoses, cercle bleu glucose. GlcI : α-glucosidases I. UGGT : UDP-glucose: glycoprotein glucosyltransferase.
Au regard du rôle d’ERManI dans la dégradation des glycoprotéines mal/non repliées, nous avons émis l’hypothèse, que son knockdown inhiberait l’envoi de F508del-CFTR vers la voie de dégradation. Cette hypothèse repose sur des études démontrant que l’inhibition de l’activité enzymatique de cette protéine, que ce soit par siRNA ou par Kifunensine, stabilise les substrats luminaux d’ERAD AAT et son mutant NHK (Avezov et al., 2008; Hosokawa et al., 2003; Pan et al., 2013; Wu et al., 2003). Afin d’apporter la preuve qui confirmerait notre hypothèse, il serait alors important de suivre le niveau d’expression de F508del-CFTR au cours du temps par la technique de pulse-chase (marquage métabolique au 35S). Elle repose sur un marquage des protéines nouvellement synthétisées par incorporation de méthionine et de cystéine marquées pendant une période déterminée (pulse), puis un suivi au cours du temps (chase), mais cette fois-ci dans un environnement non marqué, du devenir de ces protéines marquées.
Nous avons par la suite, entrepris la caractérisation du mécanisme d’action impliqué dans cette correction. Partant du fait qu’ERManI est le minuteur qui déclenche la première étape de dégradation en clivant le premier résidu de mannose, nous avions émis l’hypothèse que l’inhibition de l’interaction de F508del-CFTR avec cette enzyme diminuerait son interaction avec les protéines EDEMs. Cependant, nous n’avons détecté aucun effet de la diminution du taux d’expression d’ERManI sur l’expression protéique d’EDEM1, EDEM2 ou EDEM3, ni sur leur interaction avec F508del-CFTR, suggérant que le mécanisme d’action impliqué dans la correction de F508del-CFTR n’est pas dépendant des protéines EDEMs. Trois hypothèses ont
168 été émises pour expliquer ces résultats surprenants : (1) ERManI agirait dans une voie de dégradation indépendante de celle des EDEMs, (2) ERManI n’affecte pas l’interaction des protéines EDEMs avec F508del-CFTR mais l’inhibition du clivage du premier résidu mannose inhiberait leur activité mannosidase. Cette hypothèse est basée sur des études montrant que les protéines EDEMs peuvent interagir avec leur substrat de manière indépendante de leur activité mannosidase (Slominska-Wojewodzka et al., 2006; Kosmaoglou et al., 2009; Sokołowska et al., 2011; Shenkman et al., 2013; Slominska-Wojewodzka et al., 2014; Tang et al., 2014), ou bien, (3) ERManI agirait en aval des protéines EDEMs. En effet, une étude réalisée en 2014 par l’équipe de Mori sur la lignée de poule DT40 et la lignée tumorale de colon HCT116, a démontré par un système d’extinction de gènes, que le premier clivage de résidus mannose serait effectué par EDEM2 et non pas, par ERManI (Ninagawa et al., 2014).
A ce stade de notre étude, il est impossible de trancher entre ces trois hypothèses. En effet, bien que l’implication des trois EDEMs et d’ERManI dans la démannosylation des glycoprotéines mal/non repliées soit bien établie, l’ordre de leur action n’est à ce jour pas encore déterminé. Ainsi, face à la divergence sur le mode d’action d’ERManI, il serait envisageable d’éteindre les protéines EDEMs ou ERManI séparément par un système KO, et définir ensuite le profil en résidus mannose du N-glycane de F508del-CFTR comme décrit dans l’étude réalisée par l’équipe de Mori (Ninagawa et al., 2014). Cela nous permettrait d’identifier dans quel type de cellules les protéines avec le profil M9 s’accumulent et par conséquent quel type de mannosidase serait responsable de la catalyse du clivage de premier résidu mannose.
Dans la poursuite de notre étude, mais cette fois-ci du côté cytosolique, une diminution de l’interaction de F508del-CFTR avec l’ubiquitine ligase CHIP, la co-chaperonne de Hsp/Hsc70 et Hsp90 a été observée dans les cellules transfectées par le siRNA ERManI. Même s’il s’agit de résultats encore préliminaires, la diminution observée semble être significative. Nous nous sommes assurés par western blot que cette diminution n’est pas corrélée à une diminution du niveau d’expression protéique de CHIP, ce qui suggère qu’ERManI knockdown restaure F508del-CFTR à la membrane cellulaire en prévenant l’interaction de CHIP au complexe Hsc/Hsp70. F508del-CFTR n’étant alors pas ubiquitinylé, ne subira pas de rétrotranslocation vers le cytosol pour dégradation, favorisant sa progression dans la voie de repliement. Une étude de l’effet du siRNA ERManI sur les co-chaperonne productives tell que Hdj-2, Hop et Bag1, montrant une augmentation de leur interaction avec F508del-CFTR confirmerait cela.
169 Suite à ces résultats, nous nous sommes intéressés à l’ubiquitine ligase RMA1/RNF5, agissant en séquentiel avec CHIP pour la détection et le contrôle du repliement de CFTR. Le knockdown d’ERManI n’a montré aucun effet sur l’interaction de RMA1/RNF5 avec F508del-CFTR (résultat préliminaire) ni sur leur niveau d’expression. Au regard de son rôle de détection des défauts de repliement de CFTR, nous pensons que RMA1/RNF5 reste en permanence attaché au F508del-CFTR et que c’est sa coopération avec d’autres partenaires tel que l’ubiquitine ligase Gp78, Derlin-1 ou la co-chaperonne de Hsc/Hsp70, DNAJB12, qui déclenche le processus de dégradation de F508del-CFTR (Morito et al., 2008; Grove et al., 2011). Enfin, nous avons démontré que le knockdown d’ERManI ne présente aucun effet sur l’activité enzymatique du protéasome. Il serait intéressant d’explorer l’effet de knockdown d’ERManI sur les autres acteurs d’ERAD et les partenaires des complexes de rétrotranslocation par des techniques de Duolink et/ou de co-immunoprécipitation.
En conclusion, notre travail propose la protéine ERManI et la famille de protéines EDEM, plus particulièrement EDEM1 et EDEM2 comme cibles pour la recherche de correcteurs de F508del-CFTR (Figure 62-A). Dans cette optique, nous avons révélé l’effet correcteur du trivalent-DMJ et avons tenté de comprendre son mécanisme d’action (Figure 62-B). Il semblerait que ce composé connu comme un inhibiteur de l’activité mannosidase rétablissent l’expression membranaire de F508del-CFTR sous sa forme immature mais fonctionnelle en diminuant son interaction avec les protéines EDEMs, mais également en inhibant l’activité enzymatique du protéasome. Ainsi, la suite logique de ce travail sera de continuer à élucider le mécanisme d’action de ce correcteur et de le tester dans d’autres cas de pathologies.
170
A
B
Figure 62 : Récapitulatif des principaux résultats de ce projet de thèse.
(A) Implication des protéines ERManI, EDEM1 et EDEM2 dans la rétention réticulaire de F508del-CFTR. (B) L’effet correcteur sur F508del-CFTR du trivalent-DMJ et son mécanisme d’action.
171
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