Les interactions avec les protéines chaperonnes

a) Les lectines calnexine/calréticuline et les glycosidases

La calnexine et son homologue soluble, la calréticuline, sont deux lectines chaperonnes responsables du repliement et du contrôle qualité des glycoprotéines dans le RE (Fliegel et al., 1989; Wada et al., 1991; Michalak et al., 1992; Hebert et al., 1996). La calnexine est une protéine transmembranaire de type I, de 90 kDa qui interagit avec les glycoprotéines solubles et transmembranaires ; tandis que la calréticuline interagit préférentiellement avec les glycoprotéines solubles (Hebert et al., 1997). Ces deux lectines partagent une organisation générale similaire. Chacune possède dans sa partie N-terminale un domaine globulaire de liaison aux glucides, permettant la liaison spécifique des glycoprotéines monoglucosylées de type Glc1Man9GlcNAc2 (Kozlov et al., 2010c; Schrag et al., 2001). À partir de ce domaine s’étend une longue boucle en forme de bras appelé domaine P pour sa richesse en résidus de proline. Ce domaine a pour rôle de recruter l’oxydoreductase ERp57 (Frickel et al., 2002; Kozlov et al., 2006) et la PPIase CypB (Kozlov et al., 2010b). Le domaine globulaire des deux lectines contient également des sites de liaison pour les ions Ca²⁺ et l’ATP, deux cofacteurs régulateurs importants pour la stabilisation des lectines chaperonnes. Le Ca²⁺ régule également la liaison des lectines aux substrats (pour revue Lamriben et al., 2016).

Bien que réticulaires, ces deux chaperonnes ont également été localisées hors du RE où elles joueraient d’autres fonctions. La calréticuline a été localisée dans le cytoplasme, à la surface

19 externe de la cellule et la matrice extracellulaire ; et la calnexine à la surface cellulaire de nombreuses cellules (Michalak et al., 2009; Wang et al., 2012; Lamriben et al., 2016).

i. Cycle de la calnexine/calréticuline

La forme tri-glucosylée Glc3Man9GlcNAc2 du N-glycan des protéines nouvellement synthétisées a une demi-vie de quelques secondes. Immédiatement après son transfert sur le résidu asparagine de la chaine polypeptidique naissante, son glucose terminal est clivé avec une t1/2 < 2 min par l’action de l’α-glucosidase I, une enzyme faisant partie du complexe translocon avec l’OST (Helenius and Aebi, 2004; Dejgaard et al., 2010; Roth and Zuber, 2017).

Le carbohydrate di-glucosylé Glc2Man9GlcNAc2 ainsi généré recrute et s’associe avec la malectine, une lectine transmembranaire de type I du RE (Figure 6). Le rôle de cette protéine induite par le stress du RE serait de prévenir l’agrégation des polypeptides naissants durant la période de synthèse précoce et de recruter l’α-glucosidase II (Schallus et al., 2008; Galli et al., 2011).

Figure 6 : Interaction des glycoprotéines avec la chaperonne calnexine.

OST : oligosaccharyl transférase, BiP : chaperonne réticulaire, PDI et ERp57 : oxydoréductases, SPC : signal peptide peptidase, GlcI et GlcII : α-glucosidases I et II, Points et traits rouges : liaisons disulfures (D'après Braakman and Hebert, 2013).

L’α-glucosidase II ainsi recrutée clive le deuxième glucose avec une t1/2 ~ 5 min et génère un carbohydrate mono-glucosylé Glc1Man9GlcNAc2 qui devient ainsi un substrat pour la calnexine ou la calréticuline (Roth and Zuber, 2017). La calnexine ou calréticuline interagit avec ce N-glycan au niveau de son domaine globulaire, tandis que sa chaîne polypeptidique forme des liaisons disulfures mixtes transitoires avec ERp57. Ces interactions aident au repliement de la glycoprotéine d’une part en réduisant son espace de repliement et en conséquence le nombre de conformations potentielles, et d’autre part, en prévenant son agrégation et en facilitant l’isomérisation des ponts disulfures grâce à l’ERp57 (Jessop et al., 2007; Gidalevitz et al., 2013;

20 Lamriben et al., 2016). Ce dernier semble jouer un rôle supplémentaire dans la stabilisation de l’ensemble de ces interactions.

À la fin de son repliement, la glycoprotéine doit être relâchée de la calnexine ou la calréticuline. L’α-glucosidase II clive alors le dernier glucose du N-glycan et génère le motif Man9GlcNAc2, avec une t1/2 ~ 20 min (Roth and Zuber, 2017). Le motif généré n’est ainsi plus reconnu par les deux chaperonnes. Cependant, il pourra être reglucosylé par l’enzyme UGGT afin de restaurer son affinité pour ces lectines, on parle alors de « cycle calnexine/calréticuline » (Figure 7).

Figure 7 : Le Cycle de la calnexine/calréticuline.

(1) Assemblage de l’oligosaccharide Glc3Man9GlcNAc2,(2) Glycosylation de la protéine par l’OST, (3) Clivage de glucose par les α-glucosidases I et II, (4) Liaison de la glycoprotéine à la calnexine ou calréticuline, (5 et 8) Clivage du dernier glucose par l’α-glucosidase II, (6) Re-glucosylation des protéines n’ayant pas atteint leur conformation native par UGGT et (7) leur réentrée dans le cycle calnexine ou calréticuline pour un nouveaux cycle de repliement, (9 et 10) Les protéines correctement repliées sont démannosylées en Man8GlcNAc2 par les mannosidases du RE puis dirigées vers l’appareil de Golgi, (11) Les protéines définitivement mal repliées sont extensivement démannosylées par les mannosidases du RE puis conduites vers la dégradation hors du RE (D'après Lamriben et al., 2016).

21 L’UGGT apparait comme étant un senseur de repliement crucial dans le RE extrêmement sensible, qui peut reglucosyler les glycoprotéines mal repliées pour un nouveau cycle de repliement et ignorer les glycoprotéines natives et fortement mal conformées. Cependant, comment cette spécificité est accomplie reste encore mal comprise.

ii. Distinction des protéines correctement repliées des mal repliées

Une des questions importantes dans l’ERQC est de savoir comment ce processus distingue les glycoprotéines définitivement mal repliées de celles ayant acquis leur conformation native et surtout des intermédiaires de repliement. Il a été proposé que la présence de résidus d’acides aminés hydrophobes exposés sur la protéine mal repliée serait le motif de distinction entre les différentes formes de repliement. Ces motifs seraient reconnus par un « senseurs de repliement », l’enzyme UGGT (Lamriben et al., 2016) ou BiP, une protéine de la famille des Hsp70 (Heat Shock Protein at 70 kDa) (Flynn et al., 1991). En effet, tant qu’une protéine présente des séquences hydrophobes exposées, elle restera retenue dans le RE afin de subir d’autres cycles de repliement et d’atteindre la bonne conformation. A la fin de chaque cycle, soit la protéine est correctement repliée et pourra donc quitter le RE pour transiter vers l’appareil de Golgi, soit elle est reconnue comme définitivement mal repliée et sera alors envoyée vers le système de dégradation, ou bien, cette protéine présente toujours un repliement intermédiaire, elle subira dans ce cas-là, une autre tentative de repliement. Le système basé sur BiP est utilisé principalement pour les protéines non glycosylées ou les glycoprotéines dans lesquelles le N-glycan se produit relativement tard (Otero et al., 2010). Ainsi, nous détaillerons ici uniquement le deuxième système, propre aux glycoprotéines.

Le système de contrôle de qualité des glycoprotéines est basé non seulement sur la reconnaissance des séquences hydrophobes exposées sur la surface des glycoprotéines par l’enzyme UGGT, mais également sur la structure de leur chaine glycanique, d’où le nom de « système basé sur le code glycan ». En effet, comme nous l’avons abordé dans la partie précédente, au cours de son processus de repliement, la glycoprotéine sous sa forme mono glucosylée Glc1Man9GlcNAc2 interagit avec la chaperonne calnexine/calréticuline et subit un cycle de repliement « cycle de calnexine/calréticuline ». Suite au clivage de son résidu glucose par la glucosidaseII, la glycoprotéine sous la forme Man9GlcNAc2 n’est plus reconnue par la calnexine. A cet instant, elle va être « scannée » par l’enzyme UGGT qui reconnaît et interagit préférentiellement avec les régions protéiques hydrophobes exposées à la surface des glycoprotéines n’ayant pas atteint leur conformation native. Ainsi, trois cas de figures sont

22 possibles (Braakman and Hebert, 2013) : (1) la glycoprotéine n’expose pas de séquences hydrophobes, elle est donc correctement repliée et pourra quitter le RE et transiter vers l’appareil de Golgi (Geva and Schuldiner, 2014a), (2) la glycoprotéine expose des séquences hydrophobes, elle est donc mal repliée et sera reglucosylée par l’UGGT. Elle reforme alors un complexe avec calnexine-ERp57 afin de subir un nouveau cycle de repliement (Hebert et al., 1995), ou (3) la glycoprotéine présente toujours des séquences hydrophobes avec un repliement anormal, elle sera donc extensivement démannosylée par les mannosidases du RE afin de fournir un signal pour sa prise en charge par le système de dégradation (Helenius and Aebi, 2004).

b) Les protéines de choc thermique (Hsp)

Le système Hsp (Heat Shock Protein) est un système chaperon majeur dans le RE en plus du complexe calnexine/calréticuline (Otero et al., 2010; Balchin et al., 2016). Localisées dans le cytoplasme, le noyau ou même dans le RE, les Hsps sont des chaperonnes inductibles par le stress (Shastry et al., 2002; McClung et al., 2008). Elles sont recrutées pour aider à la maturation des protéines non glycosylées ou des domaines sur des protéines glycosylées (Beckmann et al., 1990). Certains d’entre eux identifient les protéines immatures, aberrantes ou favorables à l’agrégation de par la présence de segments hydrophobes exposés sur ces protéines (Glover and Lindquist, 1998; Ben-Zvi et al., 2004; Li and Srivastava, 2004). Ce système est également impliqué dans la transduction du signal, la régulation du cycle cellulaire, la différenciation et la mort cellulaire programmée (pour revue Jacob et al., 2017). Leur liaison est régulée par des cofacteurs adénine-nucléotidiques et cofacteurs spécialisés. Malgré ces similitudes, leur gamme de substrats et leurs rôles sont divers. Ici, nous allons nous intéresser principalement aux chaperonnes et co-chaperonnes les plus pertinentes pour notre étude.

i. Hsp70 et Hsp40

La famille des Hsp70 regroupe des protéines d’environ 70 kDa inductibles par un choc thermique. Les chaperonnes de ce système se lient à des séquences enrichis en résidus hydrophobes, typiquement exposés par des protéines mal repliées (Rüdiger et al., 1997; Swain et al., 2007; Qi et al., 2013). Leur rôle dans le repliement des protéines néo-synthétisées se caractérise par la prévention de l’agrégation, l’aide au repliement et la solubilisation des protéines agrégées.

23 Les membres de cette famille partagent une séquence composée de deux domaines : un domaine ATPase, nommé NBD (Nucteotide Binding Domain) localisé en N-terminal et un domaine de liaison au substrat SBD (Substrate Binding Domain) localisé en C-terminal. Ce dernier domaine contient une région hydrophobe appropriée en forme de poche à laquelle se fixe la protéine à replier (Mayer and Bukau, 2005). Cette poche est sous le contrôle d’un couvercle étendu, ATP-dépendant, qui peut s’ouvrir et se fermer en emprisonnant le substrat dans la poche (Mayer et al., 2000). Suite à la fixation de l’ATP au domaine NBD, le couvercle s’ouvre, permettant la liaison du substrat au domaine SBD avec une faible affinité. Cette liaison de substrat stimule l’activité ATPase de la chaperonne et par conséquent l’hydrolyse d’ATP (Flynn et al., 1989). Hsp70 lié à l’ADP acquiert ainsi une forte affinité pour son substrat et le couvercle se ferme, isolant la partie de substrat fixé au SBD. Cette liaison avec une haute affinité protège les substrats d’un repliement prématuré et de l’agrégation. Cependant, l’échange de l’ADP par un ATP résulte en l’ouverture du couvercle et par conséquent la libération de la protéine qui peut alors poursuivre son repliement.

Ce cycle de Hsp70 est régulé par des protéines de la famille Hsp40 et des facteurs d’échange de nucléotides NEF (nucleotide exchange factors). Les co-chaperonnes Hsp40 (DnaJ chez les bactéries), connue aussi sous le nom de protéines à domaine-J contiennent une région, appelée domaine J requise pour leur liaison avec les différents membres de Hsp70. Leur liaison stimule et accélère fortement l’hydrolyse de l’ATP, générant l’état fermé de Hsp70 piégeant le substrat (Kityk et al., 2012; Nunes et al., 2015). La liaison ultérieure des NEF au NBD quant à elle, facilite l’échange ADP en ATP, ouvrant le SBD et permettant la libération du substrat pour le repliement ou le transfert vers les chaperonnes en aval ou vers la machinerie de dégradation (Sharma et al., 2010; Braakman and Hebert, 2013).

Parmi les membres de la famille Hsp70, on retrouve la protéine GRP78 (Glucose Regulated Protein), connue sous le nom de BiP pour Binding Immunoglobulin Protein. Il s’agit d’une protéine soluble réticulaire de 78 kDa qui se lie à la plupart des chaines peptidiques naissantes qui transitent dans le RE. BiP est l’une des chaperonnes du RE les plus abondantes et possède de multiples rôles allant du repliement productif à une participation dans le processus ERAD. Il a été proposé que BiP serait un senseur de repliement qui distingue entre les différentes formes de repliement des protéines non glycosylées ou des glycoprotéines dans lesquelles le N-glycan se produit tardivement (Flynn et al., 1991; Otero et al., 2010).

24 L’activité ATPase de BiP, mais aussi sa localisation et ses diverses fonctions, nécessitent l’assistance des co-chaperonnes de la famille Hsp40 connues sous le nom de ERdj 1 à 7 (ER-localized DnaJ proteins) (Braakman and Hebert, 2013). Certains membres d’ERdj jouent un rôle dans le processus de repliement (Shen and Hendershot, 2005; Otero et al., 2010), alors que d’autres s’associent au protéines mal repliées et aident dans l’accélération de leur dégradation (Dong et al., 2008; Lai et al., 2012). Il a été démontré par exemple qu’ERdj5 interagit avec EDEM (ER-degradation enhancing alpha-mannosidase like protein), protéine de type α-mannosidase impliquée dans la dégradation des protéines mal repliées (Ushioda et al., 2008). De même, ERdj4 et ERdj5 surexprimés interagissent avec p97, une composante de la machinerie ERAD (Dong et al., 2008).

Les membres de Hsp70 cytoplasmiques participent aussi au bon repliement des protéines, mais des domaines exposés dans la face cytosolique du RE. Il a été démontré que Hsp70 en association avec Hsp40 et d’autres co-chaperonnes (telles que Hdj1/2, CHIP (C-terminus of Hsp70 interacting protein), HspBP1 (Heat Shock Protein Binding 1)) interviennent en complexe sur des domaines cytoplasmiques des protéines du RE. En fonction du complexe formé, la protéine sera envoyée soit vers la voie de sécrétion soit vers la voie de dégradation (Figure 8).

Figure 8 : Influence des co-chaperonnes du complexe Hsp70 sur le devenir des protéines. CHIP : C-terminus of Hsp70 interacting protein. Hdj : Human DnaJ2. Hop : Hsp-organising protein

Hsp : Heat Shock Protein. (Modifié d'après Goldberg, 2003).

Hdj1 et Hdj2 semblent faciliter le repliement des protéines (Meacham, 1999; Farinha et al., 2002). HspBP1 quant à elle, régule négativement la co-chaperonne CHIP qui augmente l’activité du système ERAD (Connell et al., 2001; Meacham et al., 2001a; Alberti et al., 2004). CHIP est une E3 ligase qui interagit avec une famille d’enzymes de conjugaison d’ubiquitine E2 (E2 ubiquitin conjugating enzymes) et se lie sur Hsp70 ou sa forme constitutivement exprimée, Hsc70 (heat shock cognate) mais également sur Hsp90 (Cyr et al., 2002). Même si

25 les deux chaperonnes lient CHIP de la même affinité, elles présentent des effets opposés sur l’ubiquitinylation de protéines. En effet, il a été proposé que Hsp70 favorise l’ubiquitinylation et la dégradation de substrats, tandis que Hsp90 les inhibe (Peng et al., 2009).

ii. Hsp90

La famille des Hsp90 regroupe des protéines d’environ 90 kDa et qui sont présentes dans la plupart des compartiments cellulaires tels que le cytosol, le RE et les mitochondries. Elles jouent un rôle dans la prévention de l’agrégation des protéines néo-synthétisées et facilitent leur repliement ou leur dégradation. Cette famille de protéine joue également un rôle essentiel dans de nombreux autres processus cellulaires, y compris la réponse de la cellule au stress, le contrôle du cycle cellulaire, la survie cellulaire et d’autres voies de signalisation (Pour revue Jackson, 2012; Mayer and Le Breton, 2015; Schopf et al., 2017).

Les membres de HSP90 fonctionnent comme des homodimères et la dimérisation est essentielle pour leur fonction in vivo (Wayne and Bolon, 2007). Un monomère de HSP90 se compose de trois domaines hautement conservés : un domaine N-terminal NTD, un domaine intermédiaire MD et un domaine C-terminal CTD. Le domaine NTD permet la fixation de l’adénine, du calcium, des co-chaperonnes et régule l’hydrolyse d’ATP (Prodromou et al., 1997). Le domaine MD possède une large boucle hydrophobe qui contrôle la fixation de l’ATP et permet la liaison de substrats. Ces 2 domaines NTD et MD sont connectés par un connecteur long, flexible et chargé qui module les contacts NTD-MD et affecte la fonction de Hsp90 (Hainzl et al., 2009; Tsutsumi et al., 2012; Jahn et al., 2014). Le domaine CTD quant à lui, est responsable de la dimérisation (Harris et al., 2004; Cunningham et al., 2008). Il contient également un motif C-terminal important pour l’interaction avec certaines co-chaperonnes (Buchner, 1999). En l’absence d’ATP, Hsp90 favorise une conformation ouverte. En revanche, lors de la liaison d’ATP, un segment de couvercle de NTD se ferme sur le nucléotide lié, conduisant à une dimérisation de NTD. Après l’hydrolyse de l’ATP et la libération de nucléotides, Hsp90 revient à son état ouvert (Shiau et al., 2006; Hellenkamp et al., 2017). Hsp90 coopère avec divers co-chaperonnes qui régulent son activité ATPase et recrutent les substrats (Li et al., 2012; Röhl et al., 2013) . Ces facteurs agissent en séquentiel le long du cycle Hsp90 et, dans certains cas, forment des complexes mixtes avec la chaperonne (Li et al., 2011). Parmi ces co-chaperonnes, Hop (Hsp-organising protein) et Cdc37 qui stabilisent la conformation ouverte du dimère Hsp90, inhibent l’hydrolyse d’ATP et facilitent la liaison avec le substrat. Hop facilite le transfert de substrat de Hsp70 vers Hsp90, alors que Cdc37

26 fonctionne comme un adaptateur pour les substrats kinase. Une autre co-chaperonne, Aha1 (Activator of Hsp90 ATPase protein 1) se lie asymétriquement au MD et NTD du dimère Hsp90, facilitant la transition vers la conformation fermée et accélérant ainsi l’hydrolyse d’ATP (Panaretou et al., 2002; Meyer et al., 2004; Koulov et al., 2010; Retzlaff et al., 2010). Quant à la co-chaperonne P23, elle agit vers la fin du cycle et facilite la maturation du substrat en stabilisant l’état fermé des domaines N de Hsp90 et en inhibant l’hydrolyse de l’ATP (Prodromou, 2000; Ali et al., 2006; Li et al., 2012). Hsp90 coopère avec une gamme d’autres cofacteurs contenant des domaines TPR (Tetratricopeptide). Certains de ces facteurs contiennent également des domaines peptidyl-prolyl-isomérase (PPIase) et participent au repliement du substrat sur Hsp90 (Taipale et al., 2012). D’autres facteurs contiennent un domaine avec une activité ubiquitine ligase comme CHIP, qui se lie aux deux chaperonnes Hsc70 et Hsp90 à travers son domaine Tetratricopeptide (TPR) (Pratt et al., 2010).

Le mécanisme d’interaction de Hsp90 avec ses substrats et comment son cycle ATPase est couplé à leur maturation n’est pas encore bien compris. Il a été cependant postulé que l’hydrolyse de l’ATP de Hsp90 régulerait le transfert du substrat de Hsp70 vers Hsp90, probablement grâce à un couplage des cycles d’ATP des deux chaperonnes (Kirschke et al., 2014). Des études avaient démontré en effet que Hsp70 et Hsp90 agiraient ensemble mais en séquentiel pour prévenir l’agrégation des chaines polypeptidiques en cours de repliement et que Hsp90 agirait en aval en se liant sur les intermédiaires de repliement tardifs (Kosano et al., 1998). De plus, le rôle de Hsp40, une co-chaperonne de Hsp70 pour l’activité de Hsp90 a été démontré in vivo par des études de génétiques dans la levure montrant que des mutations dans Ydj1 (yeast dnaJ) compromettent la capacité de Hsp90 à chaperonner les récepteurs de stéroïdes ou la protéine kinase pp60v-src (Caplan et al., 1995; Kimura et al., 1995). Sa nécessité pour l’activité de Hsp90 a également été démontrée par des études in vitro sur des complexes de Hsp90 avec le récepteur progestérone (PR) (Kosano et al., 1998; Hernández et al., 2002) ou glucocorticoïde (GR) (Dittmar et al., 1998; Kirschke et al., 2014). Il a été constaté que cette co-chaperonne se lie beaucoup plus facilement à PR dans sa forme native que sous sa forme dénaturée, suggérant que sa liaison serait la première étape pour la voie de chaperon HSP90 pour PR (Hernández et al., 2002).

Parmi les membres de la famille Hsp90, Grp94 (glucose-regulated protein 94), fortement exprimée dans la lumière du RE (Marzec et al., 2012). Il présente de nombreuses similitudes avec les Hsp90 cytosoliques. Cependant, Grp94 lie le calcium dans le RE, possède un ensemble distinct de substrats à plusieurs domaines, tous liées avec des disulfures et ne

27 présente pas de motif Tetratricopeptide (TPR) (Soldano et al., 2003; Dollins et al., 2007; Frey et al., 2007; Immormino et al., 2009; Marzec et al., 2012). Les co-chaperonnes qui pourraient moduler son activité n’ont pas encore été identifiés. Il a été démontré que GRP94 est souvent associée à BiP. L’inhibition par voie pharmacologique ou moléculaire de l’une des deux chaperonnes induit une up-régulation de l’autre chaperonne. GRP94 agirait après BiP en se liant sur les intermédiaires de repliement tardifs. Cette distinction semble être due à des indices structurels différents auxquels la GRP94 est sensible (Gidalevitz et al., 2013). Il a été observé que le knockdown de GRP94 stabilise le substrat classique d’ERAD, α-1-antitrypsin NHK (Null Hong Kong), suggérant que tout comme BiP, cette chaperonne jouerait un rôle dans l’adressage de cette protéine mal repliée vers la voie de dégradation ERAD (Christianson et al., 2008). De plus, une interaction de GRP94 avec OS-9 (OsteoSarcoma amplified 9), une protéine qui reconnait les glycoprotéines mal repliées et les envoie vers la voie ERAD a été observée (Christianson et al., 2008; Braakman and Hebert, 2013).

Tout comme Hsp70 cytosolique, Hsp90 cytosolique interagit avec les domaines cytoplasmiques de différentes protéines insérées dans la membrane du RE, dont la protéine CFTR (Cystic Fibrosis Transmembrane conductance Regulator), et influence leur stabilité.

c) Les chaperonnes de transport hors le RE

La sortie des protéines correctement repliées du RE se produit au niveau de sites spécifiques de la membrane du RE, appelés sites de sortie du RE (ERES pour ER-exit sites), qui sont séparés spatialement des régions où la translocation active a lieu. Au niveau de ces