Synthèse de dérivés de benzylguanine pour une application du SNAP-tag au fluor-18

3.1. Objectifs

Dans le cadre de marquage direct de macro-biomolécules au fluor-18 pour de futures applications in vivo, le SNAP-tag, grâce à ses propriétés, est donc une étiquette intéressante. Le marquage au fluor-18 d’un substrat du SNAP-tag et son application au radiomarquage de protéines in vivo n’ont jusqu’à présent pas été décrits. Un dérivé de benzylguanine marquable au fluor-18 et donc substrat du SNAP-tag, sera synthétisé. D’après les résultats décrits dans la littérature, le SNAP-tag peut interagir avec une grande variété de substrats O6-benzylguanine, la fonctionnalisation du groupement benzyle ne semble pas impacter significativement la ligation enzymatique du substrat à la protéine.

Les pyridines, grâce à leur réactivité, permettent un marquage rapide au fluor-18 (Résultats et discussion Chapitre 2. 1.3. a) et sont donc des composés intéressants en radiochimie. Un dérivé de benzylguanine contenant une fluoropyridine sera donc synthétisé (Figure 122) ainsi que deux précurseurs classiques pour la radiochimie des fluoropyridines, le nitro- et le triméthylammonium.

Figure 122. Schéma général de l'utilisation du SNAP-tag en radiochimie

3.2. Synthèse de la référence froide et des précurseurs de radiomarquage a) Analyse rétrosynthétique

Les deux précurseurs et la référence froide seront synthétisés par acylation de la O6-(4-(aminomethyl)benzyl)guanine avec un acide comportant un groupement radiomarquable et le dérivé fluoré, nitro- ou triméthylammonium correspondant (Schéma 55). La fluoro- et la nitro-pyridines activées seront obtenues à partir d’acide 2-chloroacétique ou d’acide chloropropanoïque et de hydroxy-2-fluoropyridine et 3-hydroxy-2-nitropyridine respectivement. Le composé triméthylammonium sera quant à lui synthétisé de la même manière à partir de la 3-hydroxy-2-diméthylaminopyridine puis

méthylé à la dernière étape avant la formation de l’amide afin de limiter les problèmes de manipulation et de purification avec le sel de triméthylammonium.

Schéma 55. Analyse rétrosynthétique de la référence froide et des précurseurs pour le SNAP-Tag

b) Préparation des acides 2((2-fluoro-/nitro-/diméthylaminopyridin-3-yl)oxy) carboxyliques

Les acides carboxyliques, dérivés des 3-hydroxypyridines, seront synthétisés en deux étapes à partir d’hydroxypyridines commerciales ou de la diméthylaminopyridine, précédemment synthétisé (Schéma 56).

Schéma 56. Schéma de synthèse des pyridines avant conjugaison avec la BG

Plusieurs essais ont été effectués pour la réaction de O-alkylation entre les 3-hydroxypyridines et des dérivés d’acide propanoïque. La réaction de O-alkylation entre 12 ou la 3-hydroxy-2-fluoropyridine commerciale et l’acide 3-chloropropanoïque avec du carbonate de potassium et de l’iodure de sodium à 70 °C n’a pas permis d’obtenir le composé désiré (Tableau 28 – entrée 1 et 2). L’utilisation de l’iodure de sodium permet de substituer d’abord le chlore ou le brome par l’iode par réaction de Finkelstein afin d’augmenter la réactivité de l’acide. Seul l’acide 3-(acryloyloxy)propanoïque 78 a été observé, obtenu suite à une réaction d’estérification intermoléculaire de l’acide 3-chloropropanoïque suivi d’une élimination. D’autres conditions ont été testées pour la réaction de 12 avec l’acide en présence d’hydroxyde de sodium dans l’eau à température ambiante pendant 6 heures mais seules la pyridine et un produit d’élimination ont été isolés (Tableau 28– entrée 3). La réaction a aussi été effectuée avec du 3-bromopropanoate d’éthyle dans les mêmes conditions à température ambiante puis à 70 °C pendant une nuit (Tableau 28 – entrée 4). Par analyse CCM, seuls les réactifs de départ étaient encore présents. Un essai avec la 3-hydroxy-2-nitropyridine et l’hydrure de sodium a aussi été

effectué à température ambiante puis à 80 °C mais aucune conversion n’a été constatée par analyse CCM et RMN (Tableau 28 – entrée 5).

Entrée Pyridine Acide Réactifs Solvant ^Température

/temps ^Résultat

1 ^K2CO3,

NaI ^{DMF 70 °C/1 nuit} _*

2 ^K2CO3,

NaI ^{DMF 70 °C/1 nuit} _*

3 NaOH Eau TA/6 h

+ pyridine

4 ^K2CO3,

NaI ^DMF

TA, 70 °C/1

nuit ^{Pas de réaction}

5 NaH DMF ^{TA, 80 °C/1}

nuit ^{Pas de réaction}

* Structures déterminées par spectrométrie de masse

Tableau 28. Essais pour la réaction de O-alkylation entre l'hydroxypyridine et l'acide propanoïque

La réaction intermoléculaire de l’acide sur lui-même étant plus rapide que la O-alkylation, d’autres conditions ont aussi été testées, notamment la réaction d’addition 1,4 entre le 3-pyridinol 12 et l’acide acrylique protégé par un groupement tert-butyle avec de l’hydrure de sodium à température ambiante mais la réaction a seulement permis de récupérer les réactifs de départ (Schéma 57).

Schéma 57. Essai de O-alkylation avec l'acide acrylique

Une étude de fonctionnalisation des pyridines par O-alkylation avec les acétates halogénés a ensuite été effectuée à partir de 12. La réaction avec de l’acide chloroacétique en présence de soude à température ambiante n’a pas permis d’obtenir le composé (Tableau 29 – entrée 1). Dans les mêmes conditions que précédemment, en utilisant du bromoacétate d’éthyle en

présence de carbonate de potassium à 70 °C, l’ammonium quaternaire 83, résultant d’une double alkylation du composé 12, a été obtenu (produit caractérisé par RMN et spectrométrie de masse) mais n’a pas été isolé (Tableau 29 – entrée 2). Afin d’éviter la quaternarisation de l’amine, la température a ensuite été diminuée; le composé désiré 81 a finalement été obtenu à température ambiante avec un rendement de 73 % (Tableau 29 – entrée 3). Dans ces mêmes conditions, la O-alkylation de 12 avec le bromoacétate de benzyle a permis d’obtenir le composés 82 dans des rendements comparables (Tableau 29 – entrée 4). Il sera utilisé pour la préparation du précurseur triméthylammonium.

Entrée Acide Base Solvant ^{Température/}

temps ^Résultat

1 NaOH Eau TA/6 h Pas de réaction

2 K2CO3 DMF 70 °C/1 nuit * 3 K2CO3 DMF TA/1 nuit 81 (73 %) 4 K2CO3 DMF TA/6 h 82 (81 %) * Structure déterminée par spectrométrie de masse

Tableau 29. Etude de la réaction de O-alkylation entre l'hydroxypyridine et des esters d’éthyle ou de benzyle

Le bromoacétate d’éthyle, toujours dans les mêmes conditions, sera utilisé avec la 2-fluoro et 2-nitropyridine et les produits de O-alkylation (84 et 85) seront obtenus avec un rendement respectif de 97 et 99 % (Schéma 58).

Schéma 58. Synthèse des pyridines fluoro- et nitro- alkylées

Les esters 82, 84 et 85 ont ensuite été saponifiés avant réaction avec le dérivé de benzylguanine. La saponification a été effectuée pour les trois pyridines avec de l’hydroxyde de sodium dans un mélange THF/eau 19/1 (Schéma 59). Les trois pyridines 86, 87 et 81 ont été obtenues avec des rendements de 98 à 99 %.

Schéma 59. Saponification des composés pyridiniques

c) Synthèse de la référence froide fluorée et du précurseur nitro-

La 2-fluoropyridine 86 et la 2-nitropyridine 87 ont été activées par un groupement