La réaction de Diels-Alder à demande inverse en électrons 1. Généralités

La réaction de click entre le trans-cyclooctène (TCO) et la tétrazine, basée sur la réaction de Diels-Alder à demande inverse en électrons (IEDDA), a été explorée pour la première fois par le groupe de Fox en 2008 et répertoriée dans la liste des réactions bioorthogonales.144 La réaction entre un trans-cyclooctène et une dipyridyltétrazine conduit à la pyridazine avec une constante de vitesse de 2000 (± 400) M-1.s-1 dans un mélange méthanol/eau (9/1). La réaction de Diels-Alder à demande inverse en électrons a l’avantage d’être une réaction très rapide et non réversible grâce à la perte d’azote moléculaire. Cette réaction peut être effectuée avec de hauts rendements dans les solvants organiques, l’eau ou encore des solutions tampons.

5.2. Mécanisme réactionnel

Les dérivés trans-cyclooctènes agissent comme diénophiles et les diaryltétrazines comme diènes par réaction de Diels-Alder. Cette réaction a lieu suivant deux étapes successives : une réaction de Diels-Alder à demande inverse en électrons suivie d’une réaction de rétro-Diels-Alder pour éliminer le diazote formé (Figure 54).

Figure 54. Mécanisme de la réaction entre un trans-cyclooctène et une tétrazine

Cette réaction est d’autant plus rapide dans l’eau, mais certaines tétrazines ne sont pas stables en milieu aqueux et peuvent conduire à une ouverture de cycle puis à la formation de 1,3,4-oxadiazole.145 Elles sont donc souvent substituées par des groupements aryles afin

d’éviter la réaction immédiate avec l’eau. Le TCO peut aussi s’isomériser dans l’eau en composé cis, conduisant à un composé moins contraint et donc moins réactif vis-à-vis des tétrazines.

Peu de temps après, la réaction entre le norbornène L71 et des monoaryltétrazines L72 a été développée par le groupe de Hilderbrand pour donner une dihydropyridazine en utilisant le même mécanisme que la réaction TCO/tétrazine (Figure 55).146 Cette réaction a donné lieu à la formation de 4 isomères différents. Le norbornène est plus stable que le trans-cyclooctène mais aussi moins réactif (k = 1,6 M-1.s-1).

Figure 55. Réaction entre la monoaryltétrazine et le norbornène

5.3. Applications au radiomarquage de macro-biomolécules avec du fluor-18

La ligation tétrazine/TCO a été utilisée dans une approche de groupe prosthétique pour le marquage au fluor-18 de peptides. Le premier groupe prosthétique synthétisé pour le marquage au fluor-18 a été développé par le groupe de Fox en 2010.147 Un premier essai a été effectué en utilisant un dérivé de tétrazine pour la conjugaison avec un trans-cyclooctène porté par la molécule d’intérêt. L’instabilité de la tétrazine et donc le rendement radiochimique de seulement 1 % a amené vers un changement de stratégie. Un dérivé de cyclooctène marqué au fluor-18 [18F]-L74 a été synthétisé à partir du précurseur nosylate avec un rendement corrigé de la décroissance de 71 % après 15 minutes de réaction. Ce dernier a ensuite été impliqué dans une réaction de conjugaison avec un peptide contenant le motif RGD préalablement fonctionnalisé par une tétrazine L75 (Figure 56).148

Un autre peptide, l’exendine-4, ligand du récepteur du glucagon-like peptide, a été marqué au fluor-18 en utilisant la même méthode que précédemment. L‘exendine-4 a été modifiée en position 12 par remplacement d’une lysine par une cystéine afin d’être conjuguée à la tétrazine fonctionnalisée avec une entité maléimide. Le radiomarquage a été réalisé par conjugaison par réaction IEDDA avec un dérivé de trans-cyclooctène marqué au fluor-18.149,150

Un travail récent avec du fluor-18 a montré que la modification de la tétrazine en ajoutant un groupement trifluorométhyle ([18F]-L77) a permis d’augmenter la stabilité métabolique (Figure 57).151 Des modifications sur le groupe prosthétique TCO ([18F]-L78) ont aussi permis d’augmenter la vitesse de reaction jusqu’à 3,3.106 M-1.s-1 (Figure 57).152

Figure 57. Modifications de la tétrazine et du TCO afin améliorer leurs propriétés 5.4. Marquage in vivo par approche de pré-ciblage

L’imagerie par pré-ciblage s’avère utile pour les macro-biomolécules dont la pharmacodistribution est lente, notamment pour les anticorps. En effet, de manière générale en imagerie, le rapport signal spécifique sur bruit est un critère majeur d’obtention d’images exploitables. Or dans le cas des anticorps, ce rapport n’est exploitable que 24 à 48 heures après injection des anticorps en raison de leur pharmacodistribution et de l’élimination lente des anticorps n’ayant pas atteint leur cible (signal non spécifique = bruit). Un marquage direct avec des radioisotopes à courte demi-vie tel que le fluor-18 n’est donc pas envisageable.

Pour utiliser des anticorps comme agents d’imagerie (ou d’autres macro-biomolécules à distribution lente), deux possibilités sont envisageables :

• Soit le radiomarquage est réalisé avec un isotope de demi-vie adaptée.

Le radiomarquage direct d’anticorps a déjà été effectué avec du cuivre-64 (t1/2 = 12,6 h) ou du zirconium-89 (t1/2 = 3,2 jours).153,154 Ces résultats de radiomarquage direct au zirconium ont permis d’obtenir des images de tumeurs avec un bon rapport signal sur bruit. Cependant, le relargage de Zr4+ dû à la chélation non optimisée ou encore la dose efficace

élevée reçue par le patient (0,53-0,66 mSv.MBq-1 contre 0,02 mSv.MBq-1 pour un examen de [18F]FDG) sont des inconvénients majeurs de cette méthode (Figure 58 A).155

• Soit une stratégie de pré-ciblage est utilisée avec des émetteurs de positons à vie brève.

Cette méthode consiste à injecter un anticorps, préalablement fonctionnalisé avec une entité chimique spécifique, puis à attendre sa distribution spécifique à sa cible (24 à 48 heures), et enfin à injecter « un effecteur » contenant le radionucléide qui réagira sélectivement avec l’anticorps fonctionnalisé (Figure 58 B).156,157 L’un des défis majeurs de cette approche est que l’anticorps et l’effecteur radioactif doivent réagir de manière chimiosélective et bioorthogonale et ce, en dépit de la grande dilution des réactifs in vivo. La réaction de l’effecteur radioactif avec l’anticorps pré-fonctionnalisé doit être rapide vis-à-vis de la période du fluor-18. Les réactions de chimie click permettent de répondre à la plupart de ces critères. Des exemples de stratégie de pré-ciblage utilisant la chimie click ont déjà été développés pour l’imagerie TEP.155,157,158 Les réactions tétrazine/TCO sont, à ce jour, les réactions de chimie click les plus rapides.

Un marquage à l’indium-111 a été développé pour des applications in vivo en imagerie TEP par pré-ciblage entre un TCO lié à un anticorps et le radionucléide porté par la tétrazine (tétrazine fonctionnalisée par un chélateur bifonctionnel DOTA pour complexer l’indium-111).159 Le composé TCO-anticorps (anticorps CC49 dirigé contre des carcinomes du colon humain) a d’abord été injecté chez la souris afin que l’anticorps se fixe sur sa cible, puis, 24 heures après, la tétrazine contenant l’indium-111 a été injectée. La fixation sur la tumeur xénogreffée a été observée 3 heures après l’injection de la tétrazine avec un important rapport tumeur/muscles de 12. Aucun signal radioactif non-spécifique dans le sang ou dans les autres organes n’a été détecté. L’élimination rapide de la tétrazine radioactive des organes non-ciblés montre sa bioorthogonalité vis-à-vis du TCO.

Plusieurs réactions de pré-ciblage ont ensuite été développées avec différents radioisotopes puis avec du fluor-18 en utilisant des tétrazines ou des trans-cyclooctènes radiomarqués [18F]-L79 à [18F]-L82 (Figure 59).152,160–162

Figure 59. Tétrazines et trans-cyclooctènes dans le cadre d’applications de pré-ciblage avec le fluor-18

L’équipe de Meyer a récemment appliqué in vivo la stratégie de pré-ciblage par ligation TCO/tétrazine à un marquage au fluor-18.161 Ils ont obtenu des images de tumeurs de cellules BxPC3 xénogreffées chez la souris en utilisant des anticorps marqués au cuivre-64 (approche directe). Dans un deuxième temps, Meyer et al. ont radiomarqué un dérivé de tétrazine au fluor-18 pour la réaction bioorthonale in vivo avec un anticorps 5B1, ciblant le marqueur d’adénocarcinome pancréatique, fonctionnalisé par un TCO. L’anticorps fonctionnalisé a été injecté à des souris porteuses de xénogreffes de cellules BxPC3 (adénocarcinome pancréatique humain) 72 heures avant l’injection de la tétrazine NOTA [18F]-L80 marquée au fluor-18 par complexation de Al[18F]2+. En imagerie TEP, la tumeur a pu être observée à partir d’une heure après l’injection de la tétrazine. Dans le tractus digestif et

les organes d’élimination (foie et reins), le signal non spécifique reste modéré. Une analyse dosimétrique a montré que cette approche de pré-ciblage a réduit d’un facteur 60 la dose efficace reçue en comparaison avec un marquage direct de l’anticorps au zirconium-89. Ces résultats permettent de conclure que l’IEDDA est une réaction bioorthogonale adaptée au radiomarquage in vivo par stratégie de pré-ciblage. Sa constante de vitesse est, par ailleurs, du même ordre de grandeur que certaines réactions enzymatiques dont les applications pour le marquage in vivo seront détaillées dans : Résultats et discussion Chapitre 4. 2.2.

6. Réaction thiol-Michael