Chapitre 4. Chimie click
4. La chimie click contrainte 1. Généralités
La première réaction de chimie click contrainte entre un cyclooctyne et un azoture de phényle a été décrite par Wittig et Krebs en 1961.121 Le cyclooctyne, plus petit cycle
contenant un alcyne stable, réagit de manière efficace et provoque « comme une explosion » lorsqu’il est mis en contact avec l’azoture de phényle à température ambiante pour former un seul produit, le triazole.
Une des premières applications de bioconjugaison a été mise en oeuvre en 2004 par le groupe de Bertozzi. Ils ont utilisé pour cela un cyclooctyne OCT (Figure 47) fonctionnalisé par une biotine pour la ligation in vitro et in vivo à la surface de glycanes préalablement fonctionnalisés avec un azoture, et ce sans toxicité apparente.122
4.2. Mécanisme réactionnel
Le mécanisme réactionnel est comparable à celui de la cycloaddition 1,3-dipolaire de Huisgen mais la tension du cycle, due au cyclooctyne, entraine une diminution de l’énergie d’activation permettant à cette réaction d’avoir lieu à des températures plus faibles voire même à température ambiante (Figure 46). Cependant, contrairement à la cycloaddition 1,3-dipolaire catalysée au cuivre (I) où seul le 1,4 triazole est formé, la réaction de SPAAC amène à la formation de deux régioisomères A et B.
Figure 46. Mécanisme concerté de la réaction de SPAAC avec obtention de deux régioisomères
En règle générale, si les groupements R1 et R2 sont encombrés, le composé B est obtenu majoritairement par rapport au composé A pour des raisons de gêne stérique.
La vitesse de réaction de la SPAAC est inférieure à celle de la CuAAC et est de l’ordre de grandeur de celle de la ligation de Staudinger (k = 2.10-3 M-1 s-1).123
Les premiers résultats en bioconjugaison ainsi que l’absence d’utilisation de catalyse au cuivre ont motivé le développement de nouveaux cyclooctynes afin d’améliorer la constante de vitesse de la réaction (Figure 47).124
Figure 47. Exemples de cyclooctynes développés pour améliorer la constante de vitesse de la réaction de SPAAC
Le composé ALO a été imaginé afin d’augmenter la solubilité en milieu aqueux du fait de l’absence de cycle aromatique mais n’a pas permis d’améliorer la constante de vitesse de la réaction.125 L’ajout d’un groupement électroattracteur en position propargylique a permis d’augmenter la vitesse de réaction. Le groupe de Bertozzi a démontré que l’ajout d’un atome de fluor comme dans MOFO, puis d’un deuxième comme dans DIFO permettaient d’augmenter la vitesse de réaction jusqu’à un facteur 32.125,126
Alors que l’équipe de Bertozzi poursuivait l’amélioration de la réactivité des fluorocyclooctynes en modifiant le DIFO127, l’équipe de Boons a choisi de s’intéresser aux dérivés de dibenzocyclooctynes. En effet, la présence des deux groupements aromatiques permet d’augmenter la tension de cycle et donc la réactivité du cyclooctyne. Le premier dibenzocyclooctyne modifié portant un alcool, le DIBO, décrit par le groupe de Boons en 2008, a permis d’obtenir une constante de vitesse de 0,057 M-1.s-1.128 La présence d’un groupement amide à l’intérieur du cycle a permis d’obtenir le composé BARAC et ainsi d’augmenter la vitesse d’un facteur 400 par rapport au composé OCT de départ avec une constante de vitesse avoisinant les 1 M-1.s-1.129 Un composé contenant un amide exocyclique, le DIBAC a aussi été développé par le groupe de Van Delft mais n’a pas permis d’améliorer la vitesse de réaction (k = 0,31 M-1.s-1).130,131 Les dibenzocyclooctynes réagissent plus rapidement mais sont aussi moins stables. Le composé BARAC, par exemple, a un temps de demi-vie de seulement 24 heures dans un tampon phosphate.
Les dernières générations de cyclooctynes132 se caractérisent par la présence d’un cyclopropane (BCN) ou d’un benzène (COMBO) à l’opposé de la triple liaison. Ceci a permis d’obtenir des composés possédant des propriétés intéressantes à la fois en termes de vitesse de réaction mais aussi en termes d’accessibilité de synthèse (4 étapes pour le BCN et 5 étapes pour le COMBO comparativement à 7 et 10 étapes pour BARAC et DIBAC respectivement) et de solubilité dans un solvant aqueux.133,134 Bien qu’ils soient moins
rapides que certains dérivés de dibenzocyclooctynes, du fait de l’absence des deux cycles aromatiques, ces composés présentent de meilleures solubilités dans l’eau. Ces derniers présentent une constante de vitesse supérieure à celles des premiers cyclooctynes développés (OCT, ALO, MOFO, DIFO) grâce au cyclopropane et au benzène permettant d’augmenter la tension du cycle à 8 chainons (k = 0,140 M-1.s-1 pour le BCN et k = 0,80 M-1.s-1
pour le COMBO dans un mélange eau/acétonitrile).
Cependant, en dépit du caractère bioorthogonal conféré à la SPAAC, les cyclooctynes peuvent réagir avec des thiols libres par addition thiol-yne en milieu biologique (Introduction Chapitre 4. 6).135,136 La difficulté de synthèse des cyclooctynes, comparativement à celle des alcynes vrais est aussi l’un des inconvénients majeurs de la réaction de SPAAC.
4.3. Applications au radiomarquage de macro-biomolécules avec du fluor-18
Grâce à l’absence de cuivre et donc à une meilleure compatibilité avec les systèmes biologiques, de nombreux couples de réactifs ont été synthétisés pour le radiomarquage de macro-biomolécules au fluor-18. Deux stratégies de synthèse sont alors envisageables. La première consiste en la préparation d’un dérivé de cyclooctyne marqué au fluor-18 pour le radiomarquage d’une molécule d’intérêt fonctionnalisée avec un azoture. La deuxième, l’inverse, un composé azoture est marqué au fluor-18 puis engagé dans une réaction de SPAAC avec une molécule d’intérêt fonctionnalisée par un cyclooctyne. Dans les deux cas, deux régioisomères sont susceptibles de se former.
La première application de marquage au fluor-18 par réaction de SPAAC a été décrite en 2011 par l’équipe de Wuest.137 Dans cet exemple, le dérivé de DBCO [18F]-L53 a été obtenu par réaction d’acylation entre un DBCO-amine commercial et le 4-[18F]fluorobenzoate N-succinimidyle [18F]SFB dans l’acétonitrile pendant 30 minutes à 40 °C (Figure 48). Après purification par HPLC, le [18F]-L53 a été obtenu avec un rendement de 85 % corrigé de la décroissance et une pureté chimique supérieure à 95 %. Une analyse du métabolisme et une étude de biodistribution effectuées sur des souris ont montré une clairance rapide dans le sang et dans les autres organes (t1/2 = 53 s).
Figure 48. Fonctionnalisation du DBCO-amine par [18F]SFB
Ce cyclooctyne a ensuite été utilisé pour la réaction de SPAAC avec des molécules modèles et des composés bioactifs fonctionnalisés par un azoture tels que des carbohydrates ([18F]-L54) et la geldanamycine ([18F]-L55), antibiotique permettant la régulation du cycle
cellulaire en dégradant les protéines altérées par des mutations (Figure 49). Cette méthode générale peut permettre le marquage d’autres macro-biomolécules.
Figure 49. Exemples d'applications avec le DBCO-4-fluorobenzoate
L’utilisation de cyclooctynes a aussi été développée dans le cadre du radiomarquage de peptides. Deux dérivés de DBCO ont permis le marquage de macro-biomolécules pré-fonctionnalisées par un azoture tel qu’un peptide A20FMDV2, ligand du récepteur à l’intégrine αvβ6 ou un peptide Tyr3-octréotate.138,139
Dans le premier exemple, la conjugaison entre un dérivé du DBCO radiomarqué au fluor-18 et un peptide A20FMDV2 fonctionnalisé par un azoture a été réalisée en 30 minutes pour obtenir [18F]-L56 avec un rendement supérieur à 70 % (Figure 50).140 A ce jour, ce conjugué n’a pas été évalué in vivo, mais la même équipe avait déjà radiomarqué ce peptide avec du 4-[18F]fluorobenzoate et du [18F]fluoropentyne et avait observé d’importantes différences de biodistribution dues aux différences de lipophilie des groupes prosthétiques utilisés.138
Dans le deuxième exemple, un peptide Tyr3-octréoate fonctionnalisé par un azoture a été marqué par du [18F]ADIBO (analogue « aliphatique » du [18F]-L53) en seulement 10 à 15 minutes de réaction afin d’obtenir [18F]-L57 avec des rendements dépassant 87 % dès 10 minutes (Figure 50).139
La biodistribution des composés radiomarqués lors d’imagerie TEP permet d’évaluer la quantité de composé fixé sur la cible d’intérêt, ainsi que sa voie d’élimination. Les propriétés physico-chimiques, dont la lipophilie, du groupement prosthétique peuvent modifier les propriétés de liaison du radiotraceur à sa cible. La taille et la lipophilie des cyclooctynes peuvent être considérées comme une limitation pour le radiomarquage de petits peptides.
L’approche inverse, correspondant à la réaction de SPAAC entre une macro-biomolécule fonctionnalisée par un cyclooctyne et un azoture marqué au fluor-18 a été développée par l’équipe de Elsinga pour le radiomarquage d’une Lys3-bombésine fonctionnalisée par un dérivé de DBCO.141 Différents azotures radiofluorés tels que l’azoture de [18F]fluorobutane [18F]-L58, l’azoture de 4-[18F]fluorobenzyle [18F]-L59 ou encore l’azoture de [18F]fluorotriéthoxybutane [18F]-60 ont été synthétisés pour cette étude avec des rendements de 19, 31 et 37 % pour les composés 18F]-L64, [18F]-L63 et [18F]-L62, respectivement (Figure 51). En dépit des modifications structurales induites par la présence du cyclooctyne radiomarqué, l’affinité du peptide pour les récepteurs « gastrin releasing peptide » reste élevée.
Figure 51. Exemples de marquage de peptide fonctionnalisé sur un dérivé DBCO avec différents azotures [18F]fluorés
En 2012, le groupe d’Evans a optimisé les conditions de radiomarquage de l’azoture de [18F]fluoroéthyle [18F]-L42 avec cinq dérivés de cyclooctynes L65 à L70 (Figure 52). Les meilleurs rendements radiochimiques ont été obtenus en réalisant la réaction dans l’acétonitrile, pendant 15 minutes à 90 °C.142
Figure 52. Etude méthodologique de température et solvants pour la réaction de SPAAC avec l’azoture de [18F]fluoroéthyle
Une problématique générale dans le radiomarquage de peptides reste la purification du produit final par HPLC, compte tenu de la stœchiométrie des réactions de conjugaison. Pour pallier le problème de séparation des réactifs (groupe prosthétique radiofluoré et peptide d’intérêt) du produit (peptide conjugué avec le groupe prosthetique radiofluoré), le groupe de Kim a proposé une méthode originale.143 Cette étude a été effectuée avec quatre peptides fonctionnalisés par un DBCO. Premièrement, la réaction de marquage au fluor-18 du groupe prosthétique contenant l’azoture, puis celle de click sont effectuées. Ensuite, un second azoture immobilisé sur une résine est introduit dans le mélange réactionnel afin de « piéger » le DBCO n’ayant pas réagi. Après filtration et lavage, les peptides marqués sont obtenus en 35 minutes de réaction avec un rendement de 92 % corrigé de la décroissance.
Figure 53. Méthode de purification de peptides développée par l’équipe de Kim143