Etiquettes enzymatiques

Ces systèmes d’étiquetage sont formés par fusion d’une protéine cible avec une enzyme qui reconnait un substrat spécifique (Figure 110 C).

a) SNAP-tag

L’équipe de Johnsson a introduit en 2003 une nouvelle approche à base d’enzyme, le SNAP-tag (Figure 113).252 La stratégie SNAP-tag dérive d’une modification de l’enzyme de réparation de l’ADN humain, l’AGT (O6-alkylguanine-DNA alkyltransferase). L’AGT « sauvage » a pour objectif de réparer les lésions mutagènes et cytotoxiques de l’ADN qui résultent de l’alkylation de la O6-benzylguanine. La réparation a lieu sur des résidus guanosines, alkylés en position 6-oxo, par transfert du groupement alkyle sur une cystéine réactive. Par mimétisme avec ce mécanisme de réparation de l’ADN, le SNAP-tag est obtenu par fusion d’une protéine d’intérêt avec cette enzyme qui reconnait spécifiquement un dérivé O6-benzyle de la guanine. L’enzyme catalyse la substitution du groupement O6-benzylguanine par une cystéine créant ainsi une liaison covalente entre l’enzyme et le fluorophore. Le SNAP-tag est une protéine monomérique de 182 résidus (20 kDa) qui permet de marquer de manière efficace les cellules vivantes 253

Figure 113. Mécanisme pour le marquage de molécules avec l'utilisation de l’étiquette enzymatique SNAP-tag

Le SNAP-tag a déjà été utilisé comme étiquette pour des marquages de protéines de fusion exprimées dans différents compartiments cellulaires tels que le cytosol, le noyau, le réticulum endoplasmique et la mitochondrie.254,255 Quelques exemples d’applications de l’outil SNAP-tag seront détaillés dans : Résultats et discussion Chapitre 4. 2.

b) CLIP-tag

Le SNAP-tag a par la suite été modifié par l’équipe de Johnsson en 2008 pour créer le CLIP-tag.256 En utilisant la même stratégie que pour le SNAP-tag, le CLIP-tag est formé à partir d’une AGT modifiée reconnaissant de manière spécifique les dérivés de cytosine O-benzylée. De manière analogue au SNAP-tag, après reconnaissance du substrat par l’enzyme, le benzyle est transféré sur la cystéine du site actif et permet le marquage d’une protéine d’intérêt par l’intermédiaire d’une O-benzylcytosine portant un fluorophore.

Figure 114. Mécanisme pour le marquage de molécules avec l'utilisation de l’étiquette enzymatique CLIP-tag c) HaloTag

Le HaloTag est une modification de l’haloalcane déhalogénase qui réagit de manière covalente avec des chloroalcanes, notamment avec le 1-(2-(2-aminoethoxy)ethoxy)-6-chlorohexane commercial, préalablement conjugués avec un fluorophore.257 Comme pour les deux autres étiquettes, la réaction est spécifique, a lieu rapidement y compris dans des conditions physiologiques et est irréversible. Des applications en imagerie cellulaire ont été décrites pour analyser divers processus moléculaires.258

d) TMP-tag

Les groupes de Cornish et de Sheetz ont développé en 2005 une sonde à partir de la dihydrofolate réductase d’E. Coli (eDHFR) modifiée.259 Cette dernière se lie de manière non

covalente à la 2,4-diamino-5-(3,4,5-trimethoxybenzyle) pyrimidine plus connue sous le nom de triméthoprime (TMP), antibiotique servant à bloquer le développement de bactéries, qui est préalablement conjuguée avec une sonde fluorescente. La TMP peut être modifiée en modulant les positions méthoxy, tout en conservant une bonne affinité avec l’eDHFR, et différentes sondes peuvent aussi être utilisées.260 Un dérivé de TMP a été obtenu pour former une liaison covalente par addition de Michael entre l’eDHFR, modifiée par une cystéine à sa surface, et la TMP, fonctionnalisée par un acrylamide (Figure 115).261 Cette sonde a été utilisée pour le marquage de protéines intracellulaires.

Figure 115. Marquage par formation d’une liaison covalente entre l'eDHFR et la triméthoprime par addition de Michael 1.5. Etiquette polypeptidique et catalyse enzymatique secondaire

Dans cette approche, une enzyme naturelle permet de lier la sonde à une petite séquence de reconnaissance de la protéine d’intérêt (Figure 110 D). Ces enzymes reconnaissent une gamme variée de substrats dérivés de leur substrat spécifique, ce qui en fait un bon outil d’étiquetage de protéines. L’enzyme catalysant la ligation du substrat n’étant pas fusionnée au polypeptide de reconnaissance, il n’est pas nécessaire d’exprimer une protéine de fusion avec une enzyme de haut poids moléculaire comme c’est le cas avec les étiquettes enzymatiques fusionnées.

Ces étiquettes permettent un marquage plus rapide et spécifique qu’avec les étiquettes de reconnaissance. L’exemple avec la biotine ligase d’E. coli est présenté ci-dessous (Figure 116).

BirA permet le transfert d’une biotine ou d’un isostère de biotine, comme la cétobiotine portant une fonction cétone, sur une lysine d’un peptide accepteur de 15 acides aminés. Le marquage de la protéine d’intérêt se fait dans un deuxième temps par ligation sur la fonction cétone. D’autres biotines ligases peuvent aussi reconnaitre des biotines portant une fonction alcyne ou azoture, qui permettra par réaction de CuAAC d’introduire la sonde dans un deuxième temps.262,263

Figure 116. Principe de marquage d'un peptide accepteur par transfert de biotine catalysé par une enzyme 1.6. Résumé et comparaison des différentes étiquettes

Les différentes étiquettes présentées ci-dessus permettent de marquer des macro-biomolécules avec des fluorophores avec des constantes de vitesse variées (Tableau 27).245

Méthode de marquage Vitesse (M-1.s-1)

Tétracystéine 104-105 SNAP-tag 3.104 CLIP-tag 103 HaloTag 3.106 TMP-tag 10-100 CuAAC 10-100 TCO/Tet 210-2800

Tableau 27. Constantes de vitesse des différentes étiquettes existantes dans la littérature

Les réactions de marquage réalisées par ces étiquettes sont intéressantes puisque leurs constantes de vitesse sont bien plus élevées que celles des réactions de chimie click telles que la CuAAC ou encore tétrazine/trans-cyclooctène. Le SNAP-tag est une étiquette pertinente pour le marquage rapide de la protéine d’intérêt. Son substrat, la O6 -benzylguanine peut être modifiée pour un radiomarquage au fluor-18. Les avantages de l’étiquette enzymatique SNAP-tag sont les suivants :

• Une meilleure spécificité en comparaison avec la reconnaissance enzymatique directe,

• Un bon compromis parmi toutes les étiquettes enzymatiques fusionnées puisque seul le HaloTag est plus rapide mais ce dernier requiert l’utilisation d’un dérivé chloré, ce qui pourra être un inconvénient lors du marquage au fluor-18 puisque le fluor pourrait substituer le chlore,

• L’application in vivo. Les systèmes catalysés par une enzyme (Biotine ligase) sont plus compliqués à mettre en œuvre et ne peuvent être utilisés in vivo mais seulement in vitro,

• Une constante de vitesse élevée, potentiellement compatible avec les quantités de substrat marqué au fluor-18 (de l’ordre de la nmole) qui pourraient être injectées pour un marquage in vivo. Elle est 300 fois supérieure par rapport à la CuAAC et de 10 fois par rapport à tétrazine/trans-cyclooctène.

De nombreuses applications ont déjà été décrites en imagerie de fluorescence avec cette étiquette enzymatique et certaines d’entre elles sont détaillées dans le paragraphe suivant.

2. Applications