Surexpression du gène EguCBF1a ou 1b chez l’E urophylla x E grandis en culture in vitro

IV.1. Construction des vecteurs

La technique Gateway (Invitrogen) a été utilisée pour la réalisation des vecteurs de surexpression. Cette technique permet d’insérer la séquence d’intérêt dans un vecteur gateway par recombinaison en utilisant deux enzymes particulières (BP et LR clonase). Les recommandations du fournisseur ont été suivies pour la majorité des étapes. La première consiste à amplifier la séquence d’intérêt et y ajouter par PCR les éléments de recombinaison AttB1 et 2 (Fig m&m-4). Il est ensuite préconisé de purifier le fragment PCR, mais les fragments amplifiés étant courts (environ 600 pb), la technique proposée n’est pas appropriée. Une migration sur gel a permis de constater que le produit PCR était suffisamment « propre » pour réaliser la suite du protocole sans étape de purification du produit PCR. La deuxième étape a pour but d’insérer par recombinaison la séquence d’intérêt (sous forme de produit PCR) dans un « vecteur donneur », ici le pDNOR201 (Annexe 5), en utilisant une enzyme la BP clonase. A l’issue de cette réaction, le vecteur d’entrée est obtenu et permet d’insérer la séquence d’intérêt dans le vecteur de destination, ici le pK7WG2D (Annexe 6), en le combinant à la LR clonase. Cette dernière étape permet d’obtenir le vecteur d’expression qui est ensuite intégré par transformation dans le plasmide Ti de la souche d’agrobactérie AGL1. Les agrobactéries sont résistantes à la rifampicine et le vecteur apporte la résistance à la spectinomycine. Les bactéries résistantes sont ainsi sélectionnées sur LB additionné de rifampicine (20µg/ml) et de spectinomycine (100µg/ml). Les agrobactéries transformées sont ensuite conservées en glycérol-stock à -80°C. Avant son utilisation pour la transformation des plantes, l’insert a été séquencé pour vérifier la séquence amplifiée dans la première étape.

Ce protocole a été suivi pour la construction des vecteurs de surexpression EguCBF1a et 1b. Deux couples d’amorces ont été utilisés pour la première étape permettant d’amplifier l’ORF du gène EguCBF1a ou bien celle du gène EguCBF1b (Annexe 7).

Matériel et Méthodes

IV.2. Transformation d’E. urophylla x E. grandis clone 201

La transformation a été réalisée sur des microboutures d’E. urophylla x E. grandis en cuture in vitro conservées comme décrit dans le paragraphe I.3. Le protocole de transformation suit celui décrit par Tournier et al. (Tournier et al., 2003). La composition de tous les milieux utilisés se trouve en annexe 8 à 11.

Sur des microboutures âgées de 2.5 à 3 semaines, les feuilles situées juste en dessous du bourgeon apical sont prélevées, puis coupées en deux dans le sens de la largeur dans une solution antioxydante préparée le jour même (annexe 10). Après les avoir séchés sur du papier Whatman stérile, les morceaux de feuilles sont déposés sur un milieu de réactivation cellulaire, le BIPA (annexe 8). L’ensemble reste 2 jours à 23°C à l’obscurité. En parallèle, des agrobactéries sont mises en préculture dans du milieu MYA (5ml) avec antibiotique (rifampicine, spectinomycine) à 28°C pendant 24h sous agitation à 200 rpm (annexe 9). La culture est ensuite repiquée dans 90 ml de milieu MYA et remise dans les mêmes conditions de culture.

Lorsque la culture d’agrobactéries a une DO600 entre 0.6 et 1 (optimum 0.8), elle est

centrifugée (10 min à 5000 rpm) et le culot est repris dans la solution C additionnée de proline (1µM) pour atteindre une DO600 de 0.5 (annexe 8). Cette suspension bactérienne est aliquotée

à raison de 1ml par tube eppendorf et 40 morceaux de feuilles y sont immergés. L’ensemble subit une sonication de 15s, puis une infiltration sous vide de 5 minutes. Les morceaux de feuilles sont ensuite séchés et déposés sur milieu A2A et mis en culture pendant 5 jours, à 23°C à l’obscurité (annexe 8). Les morceaux de feuille sont ensuite transférés sur milieu sélectif BITAugK et repiqués sur un milieu neuf toutes les 2 semaines pendant 60 jours (annexe 8).

Au total, sur ces expériences de transformations indépendantes, 640, 920 et 640 morceaux de feuilles ont été mis en coculture respectivement pour la surexpression du gène EguCBF1a, 1b et le contrôle (vecteur vide).

IV.3. Sélection des transformants

L’insert porte le gène de la GFP et celui de la résistance à la kanamycine. Après avoir testé différentes concentrations de kanamycine, nous n’avons pas pu déterminer la concentration permettant la sélection sans avoir d’impact sur la régénération. L’expression de la GFP a donc servi pour la sélection visuelle. En effet, dès le 5ième jour de coculture, la GFP

Matériel et Méthodes

est visible à la loupe binoculaire sous forme de petits points verts lorsque l’on éclaire dans le bleu, pouvant correspondre à des cellules transformées c'est-à-dire des événements de transformation. Les jours suivants ces points grossissent, la division de la cellule de départ formant ainsi un groupe de cellules transformées. Ces premières observations permettent de savoir si la transformation a été effective.

Sur le milieu BITAugK puis SDM les bourgeons régénérant à partir des cals sont observés tous les 15 jours environ afin de sélectionner les bourgeons transformés exprimant la GFP. Les bourgeons GFP+, isolés par découpage de la zone au scalpel, sont repiqués sur milieu SDM en vue de leur multiplication.

Sensi ble (-) (+) 23°C 5 jrs -7.5°C, Toléra nt 22°C 1°C/h 1°C/h -1°C Pendant 16h -8°C, ou -8.5°C

Fig m&m-5 : Méthode de mesure de la tolérance au gel des explants transgéniques en culture in vitro.

Les explants sont mis en culture dans des tubes Falcon contenant 15ml de milieu M pendant 5 jours. Ils sont ensuite soumis à un programme de refroidissement dans un cryostat : passage de 22°C à -1°C avec une vitesse de refroidissement de -1°C/h, puis maintien de la température pendant 16h, et enfin baisse de la température jusqu’à la température de gel choisie (-1°C/h). Les explants sont ensuite remis en culture à 23°C pendant une nuit, puis repiqués sur un nouveau milieu M et la reprise de croissance est observée après 5 jours. Si l’explant reprend sa croissance malgré le gel il est tolérant (+), sinon il est considéré comme sensible (-).

Matériel et Méthodes