Matériel et Méthodes
V. Phénotypage des transformants E urophylla x E grandis
V.1. Détermination de la tolérance au froid
V.1.1. Estimation de la tolérance au gel
Un test basé sur la récupération des explants ayant subi des températures gélives a été mis au point (Fig m&m-5).
Les explants dans des tubes falcon (50 ml) contenant 15 ml de milieu M sont soumis à une diminution progressive de la température dans un cryostat. Avec un refroidissement de 1°C/h les explants passent graduellement de 22°C à -1°C. Cette température est maintenue pendant 16h, puis diminue jusqu’à -8.5°C avec une vitesse de 1°C/h. A différentes températures de congélation, les tubes sont sortis du cryostat et décongelés doucement à 23°C pendant la nuit. Après décongélation, le milieu de culture perd sa solidité, et les explants sont donc repiqués dans de nouveaux tubes contenant du milieu M. Après 5 jours, la récupération des explants est observée et notée : (+)= reprise de croissance (tolérant) et (-)= mort de l’explant (sensible). Pour déterminer la viabilité d’une lignée, 12 explants au minimum sont étudiés.
V.1.2. Programme d’acclimatation
Une semaine avant le début de l’acclimatation, les explants âgés de 3 semaines sont repiqués, dans des tubes Falcon de 50ml contenant 15ml de milieu M et remis en culture pendant 5 jours à 23°C/22°C. Les explants sont exposés ensuite à une diminution progressive des températures qui débute par 4 jours à 12°C jour et 8°C nuit, puis 7 jours à 8°C jour et 4°C nuit et enfin 7 jours à 4°C jour et nuit. La tolérance au gel est mesurée avant l’acclimatation (J0), à J10 et à la fin de l’acclimatation (J18).
V.2. Détermination de la tolérance à la sécheresse
Pour tester leur résistance à la sécheresse, les explants sont posés sur du papier Whatman et placés à 23°C à l’obscurité. La perte de poids est mesurée toutes les heures. Les résultats sont exprimés en pourcentage de masse de matière fraîche perdu par rapport au poids
Matériel et Méthodes
de départ pour un explant, ce qui représenterait la perte d’eau. Le test de Student a permis de mettre en évidence les différences significatives lorsque la p-value était inférieure à 0.05.
V.3. Dosage des anthocyanes
Les anthocyanes sont extraites à partir de 200mg d’explants broyés dans l’azote liquide suivant le protocole de Close et al. (Close et al., 2000). Le solvant pour l’extraction est une solution d’éthanol additionnée de la quantité d’HCl nécessaire pour atteindre pH 1. L’absorbance est mesurée à 530 et 657 nm. La formule Absorbance530 -0.25 × Absorbance657 a
été utilisée pour atténuer les effets des déchets de chlorophylles présents dans la solution. Le résultat est exprimé en contenu en anthocyane (A530-0.25A657) par mg de poids frais.
V.4. Microscopie
Les expériences ont été réalisées avec l’aide d’Yves Martinez et d’Alain Jauneau sur les équipements de la plateforme de microscopie de l’IFR40.
V.4.1. Fixation des échantillons
Les échantillons de feuille à analyser sont fixés dans une solution de glutaraldéhyde 2.5% dans 0.05 M de Cacodylate de sodium pH 7,1. La fixation dure 2 jours à 4°C. Les feuilles âgées sont séparées des feuilles jeunes. Pour chaque échantillon, au moins 2 explants sont utilisés et 10 feuilles par explants (5 jeunes, et 5 âgées).
V.4.2. Observation de la surface des feuilles-MEB
Les échantillons fixés dans le tampon glutaraldéhyde/cacodylate sont déshydratés dans des bains de concentration croissante d’éthanol (20, 40, 60, 80 et 100%). Ils subissent ensuite une déshydratation au point critique (CPD 750 Emscope), puis sont recouverts d’une solution d’or-platine. Ils sont ensuite observés avec un microscope à balayage (Hitachi, Ibraki, Japon).
L’analyse des images a permis de déterminer l’index stomatique (SI) qui correspond à la densité de stomates / densité de cellules de l’épiderme x 100. Le SI représente le nombre de stomates pour cent cellules de l’épiderme. Un test de student a ensuite été utilisé pour
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comparer les valeurs. Lorsque le p est inférieur à 0.05, les valeurs sont considérées comme significativement différentes.
V.4.3. Observation à l’aide du microscope à épifluorescence
Deux types d’échantillons ont été observés au microscope à épifluorescence (LEICA DM IRBE) : des coupes ultrafines et des feuilles entières.
Les feuilles entières sont directement placées entre lame et lamelle, l’autofluorescence des glandes à huile a permis de les visualiser et de les compter en utilisant le logiciel Image Pro Plus (version 4.5.0.29). Comme pour le comptage des stomates, un index a été déterminé pour les glandes à huile et les valeurs obtenues comparées en se basant sur le test de Student.
Après la fixation, les échantillons sont déshydratés par une série de rinçages à l’éthanol 20%, 40%, 60%, 80% et 100%. Ils sont ensuite inclus dans de la résine LR White et huit coupes transversales ultrafines de 1µm sont réalisées au microtome à trois niveaux différents de la feuille (partie haute, moyenne et basse). Ces coupes sont déposées sur une lame et colorées au bleu de toluidine (dilué à 0.01M) pendant 1min 30s avant l’observation.
L’analyse des images par Image Pro Plus (version 4.5.0.29) a permis de mesurer l’épaisseur des feuilles. Les résultats représentent une moyenne des mesures. Une analyse statistique (test de Student) a été menée pour mettre en évidence les différences significatives entre les lignées transgéniques et la lignée contrôle.
Plantes T1 GFP+ et KanaR Graines T1
Autofécondation
Graines T2
Lot de graines présentant 75% de plantules GFP+ et KanaR Infiltration par des
agrobactéries contenant le vecteur d’expression Plantes T2 GFP+ et KanaR Autofécondation Graines T3 100% de plantules GFP+ Lot de graines présentant
Plantes T3 GFP+ et KanaR homozygotes
Fig m&m-6 : Obtention de lignées homozygotes transgéniques d’A. thaliana (T3).
Des A. thaliana (Col 0) au stade « hampe florale » sont transformées génétiquement en mettant en contact leurs fleurs et une solution d’agrobactéries portant le vecteur d’expression (« floral dipping »). Les graines obtenues après autofécondation de ces plantes (graines T1) sont semées sur un milieu MS contenant de la kanamycine (70mg/l). Quinze plantules KanaR et GFP+ sont repiquées en motte giffy puis en terreau (plantes T1). Les graines récoltées (graines T2) sur chacune des plantes sont semées sur milieu MS+kanamycine et pour chaque lot de graines présentant 75% de graines KanaR et GFP+, dix plantules KanaR et GFP+ (plantes T2) sont repiquées. Dans la descendance (graines T3), les lots de graines composés à 100% de graines KanaR et GFP+ sont des lignées transformées homozygotes possédant une seule copie du transgène. La présence de l’insert est ensuite vérifiée par PCR, la quantité de transgène est quantifiée par RTqPCR et la croissance, le développement ainsi que la tolérance au gel sont évalués.
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