Données complémentaires sur les 6 lignées sélectionnées

II.4.1. L’expression des gènes CBFs

Afin de connaître l’impact de la surexpression du gène EguCBF1a ou 1b sur l’expression des trois autres gènes EguCBF1s, nous avons déterminé la quantité de transcrits de chacun d’eux dans les six lignées sélectionnées (Fig.II-7).

Dans le cas de la surexpression du gène EguCBF1a, on observe des modifications dans la lignée A1 où le gène EguCBF1c est quatre fois plus représenté et dans la lignée A21 dans laquelle le gène EguCBF1b est environ trois fois plus exprimé. Mais ces changements ne semblent pas être en lien avec le niveau de transgène et ne sont pas reproduits entre les trois lignées de la gamme. De plus, la quantité de transcrits la plus importante s’élève à 352 copies de transcrits par µg pour le gène EguCBF1b alors qu’en condition d’induction à 4°C (5h), il peut atteindre jusqu’à près de 25000 transcrits par µg (annexe 12).

Lorsque le gène EguCBF1b est surexprimé, seul le gène EguCBF1d est augmenté (x3) dans la lignée B14 pour atteindre un nombre de copies de transcrits de 112, qui semble faible comparé à la valeur atteinte après un choc à 4°C (3990). Comme dans la surexpression du gène EguCBF1a, cette modification n’est pas observée dans les autres lignées de la gamme.

Il semble donc que la surexpression du gène EguCBF1a ou 1b n’affecte pas de manière significative le niveau endogène des gènes EguCBF1s. Il n’y aurait donc pas de régulation (autorégulation ou de façon indirecte) d’EguCBF1a ou 1b sur les autres gènes EguCBF1s. Chez Arabidopsis, l’analyse du cbf2 où le gène AtCBF2 est éteint a montré une répression exercée par cette protéine sur les gènes AtCBF1 et AtCBF3 (Novillo et al., 2004). Par contre, les mutants RNAi dans lesquels les gènes AtCBF1 ou 3 sont éteints, ne présentent pas d’altération de l’expression des autres gènes AtCBFs (Novillo et al., 2007).

II.4.2. Les autres gènes testés impliqués dans la tolérance au froid

Dans la publication, l’induction de cinq gènes impliqués dans la tolérance au froid est présentée dans les lignées A1 et B9. Cependant, d’autres gènes issus de la banque d’ADNc ont été testés sur les trois lignées de chaque gamme (Keller et al., 2009). Ces gènes ont été sélectionnés car ils sont retrouvés dans le régulon CBF d’Arabidopsis thaliana. De plus, les gènes Lti6b (protection contre la déshydratation), Pollencoat (protection membranaire), Gigantea, et Constans (contrôle de la floraison) ont été choisis car l’analyse de la banque a

Tableau II-2 : Niveaux d’induction de gènes connus pour leur implication dans le froid dans trois lignées surexprimant le gène EguCBF1a (A1/A21/A25) et trois lignées surexprimant le gène EguCBF1b (B8/B9/B14).

A1 A25 A21 B8 B9 B14 DHN1 5,5 ±1,3 1,6 ±1,7 1,7 ±1,2 4,1 ±0,7 1,8 ±0,1 1,1 ±1,1 Lti6b 5,2 ±0,4 2,2 ±0,2 1,2 ±0,2 3,3 ±1,3 1,7 ±0,2 0,5 ±0,0 Galactinol Synthase 2,9 ±0,5 1,0 ±0,1 2,0 ±1,8 3,1 ±3,3 0,8 ±0,9 1,8 ±0,6 Metallothionéïne 44,6 ±11,3 24,2 ±17,8 62,3 ±60,2 31,4 ±10,2 6,0 ±5,8 7,0 ±6,5 Constans 9,7 ±8,2 1,9 ±0,8 22,4 ±27,3 7,1 ±2,0 1,5 ±1,8 0,8 ±1,0 HSP70 0,2 ±0,0 0,3 ±0,0 1,2 ±0,3 1,1 ±0,4 0,7 ±0,1 0,6 ±0,5 Gigantea 0,3 ±0,1 0,3 ±0,2 1,3 ±0,6 0,1 ±0,0 1,8 ±0,6 0,6 ±0,4 Thioredoxine 4,4 ±0,1 3,5 ±2,2 4,9 ±3,8 4,3 ±0,3 5,3 ±0,2 1,1 ±0,4 DHN2 127,5 ±19,1 649,6 ±56,5 69,1 ±34,2 66,6 ±16,0 25,3 ±16,0 43,7 ±9,2 Myb 1,5 ±0,6 3,2 ±1,2 6,7 ±5,4 4,8 ±0,3 1,3 ±0,9 1,1 ±0,1 Sucrose synthase 1,1 ±0,3 2,5 ±0,2 3,6 ±1,5 2,8 ±0,1 3,8 ±1,6 0,7 ±0,1 Pollencoat 1,9 ±1,3 1,7 ±2,3 1,2 ±0,3 0,5 ±0,7 0,9 ±0,7 0,8 ±0,4 RD22 0,3 ±0,2 0,4 ±0,1 0,8 ±0,1 0,9 ±0,3 0,2 ±0,1 0,1 ±0,1 Ga20ox 1,1 ±0,8 0,9 ±0,0 3.1 ±3,9 1,2 ±0,3 0,7 ±0,5 1,3 ±1,4 Les lignées sont classées par ordre décroissant de niveaux de transgène, calculé par rapport au pK7 à 23°C. L’écart type est indiqué après le signe ±.

En rouge ou bleu les valeurs qui représentent une induction significative, en vert une répression significative et en gris les valeurs qui ne montrent pas de modifications.

DHN : déhydrine ; Lti6 : Low Temperature Induced ; HSP70 : Heat Shock Protein; RD: Responsive to Dessication; Ga20ox : Gibberellin 20 oxydase.

Chapitre 2 - Surexpression des gènes EguCBF1a ou 1b chez E. urophylla x E. grandis et Arabidopsis thaliana

permis de les désigner comme des gènes fortement exprimés en réponse au froid. Le gène de la Ga20ox a été testé afin d’observer une éventuelle modification de la voie des gibbérellines.

Ces informations complémentaires permettent de mettre en évidence les gènes potentiellement régulés par les CBFs parce qu’ils ont un taux d’induction lié au niveau de transcrits du transgène. Dans ce cas, les gènes pourraient appartenir au régulon CBF.

Dans les lignées A1, A25 et A21 les gènes DHN1, Lti6b, Galactinol Synthase, Metallothionéïne et Constans présentent une induction qui augmente avec le niveau de transcrits du transgène, alors que les gènes HSP70 et Gigantea sont d’autant plus réprimés que le niveau de transcrits du transgène est élevé (Tableau II.2). Le gène de la Thioredoxine est induit dans les trois lignées à des niveaux identiques. L’ensemble de ces gènes pourraient appartenir au régulon d’EguCBF1A. Les gènes qui présentent l’induction la plus forte dans les lignées A25 ou A21, comme DHN2 et Myb et Sucrose synthase ne feraient pas partie du régulon EguCBF1A. Enfin, l’expression de deux gènes n’est pas modifiée : RD22 et Pollencoat.

Donc les gènes : DHN1, Lti6b, Galactinol Synthase, Metallothionéïne, Constans, HSP70,

Gigantea et Thioredoxine pourraient appartenir au régulon d’EguCBF1A.

Est-ce que le régulon d’EguCBF1B est le même pour ces 13 gènes testés?

En analysant l’expression des mêmes gènes dans les lignées qui surexpriment le gène EguCBF1b, on peut supposer que les gènes : DHN1, Lti6b, Metallothionéïne, Constans, Gigantea et Thioredoxine peuvent aussi appartenir au régulon d’EguCBF1B. Par contre, les gènes DHN2 et RD22 n’appartiennent probablement pas au régulon d’EguCBF1B car leur régulation est indépendante du niveau de transgène. Contrairement aux lignées surexprimant le gène EguCBF1a, le gène Myb et le gène de la Sucrose synthase pourraient faire partie du régulon CBF. Enfin, l’expression des gènes Galactinol synthase, HSP70 et Pollencoat n’est pas modifiée.

Donc les gènes : DHN1, Lti6b, Metallothionéïne, Constans, Gigantea, Thioredoxine, Myb et Sucrose synthase pourraient appartenir au régulon d’EguCBF1B.

Si l’on compare la régulation des gènes testés entre les deux surexpressions, on constate que les deux régulons potentiels ont des gènes en commun (écrits en gras) et peut- être quelques gènes spécifiques : galactinol synthase, HSP70 pour EguCBF1A et Myb et Sucrose synthase pour EguCBF1B. Les gènes DHN1, Lti6b, Métallothionéïne et Thioredoxine (en commun dans les deux régulons) sont connus pour être impliqués dans la mise en place de

Chapitre 2 - Surexpression des gènes EguCBF1a ou 1b chez E. urophylla x E. grandis et Arabidopsis thaliana

l’acclimatation en protégeant les membranes (DHN1 et Lti6b) et détoxifiant le milieu intracellulaire (Métallothionéïne et Thioredoxine). Par ailleurs, le gène Gigantea est réprimé alors qu’on pouvait s’attendre à une induction, étant donné sa forte représentation dans la banque de feuilles acclimatées. Cependant, c’est un gène qui est impliqué dans la mise en place de la floraison en réponse à la photopériode et la régulation au stade « microbouture » diffère peut-être totalement de celle au « stade plante adulte ». En revanche, le gène Constans qui est aussi impliqué dans la floraison, est connu pour être un répresseur, et est induit dans les microboutures transgéniques d’E. urophylla x E. grandis.

Le gène Pollencoat, gène candidat proposé après l’analyse de la banque, ne semble pas être induit lors de la surexpression. Il semblerait donc que son expression en réponse au froid soit régulée par une voie différente de celle des CBFs. Les gènes RD22 et HSP70 sont connus pour être impliqués dans la réponse au froid, pourtant leur expression n’apparaît pas modifiée lors de la surexpression. Il pourrait aussi s’agir d’une régulation faisant intervenir une voie différente de celle des CBFs.

Cependant, cette composition des régulons reste hypothétique : il est nécessaire dans un premier temps de confirmer ces régulations en répétant les mesures pour certains car les écarts-types sont importants. De plus, il est surprenant que le gène de la DHN2 n’appartienne pas à un des deux régulons. Il serait aussi intéressant d’obtenir les promoteurs de ces gènes afin de prédire la présence d’éléments CRT/DRE, et finalement de tester la liaison des EguCBF1s sur les promoteurs de ces gènes.

D’après la littérature, les phénotypes de réduction de la croissance lors d’une surexpression d’un gène CBF peuvent être annulés par un ajout de gibbérelline. Il semble donc que la surexpression d’un gène CBF entraîne des modifications de la voie de biosynthèse des gibbérellines. Des travaux récents, suggèrent que les CBFs induisent la GA2 oxydase qui inactive les gibbérellines (Achard et al., 2008).

Dans la banque, aucune séquence n’a d’homologie avec un gène codant une GA2 oxydase. Par contre, celle correspondant à la GA20 oxydase est disponible. Le fait que cette enzyme soit impliquée dans l’activation des gibbérellines, laisse penser qu’elle pourrait être inhibée lors de la surexpression d’un gène CBF. Cependant, dans les lignées testées, l’expression de la GA20ox n’est pas modifiée, comme décrit chez Arabidopsis thaliana.

Chapitre 2 - Surexpression des gènes EguCBF1a ou 1b chez E. urophylla x E. grandis et Arabidopsis thaliana

III. Surexpression des gènes EguCBF1a ou 1b chez E. urophylla x E.