Implication des gènes DREB et ERF dans le développement ?

Au regard des phénotypes liés au développement décrits ci-dessus, une question se pose : les facteurs de transcription DREB et ERF sont-ils impliqués dans ces mécanismes en conditions naturelles, ou les effets observés sont-ils dûs à la production massive de transcrits dans tous les organes des lignées transgèniques surexprimant de façon constitutive ces facteurs?

En ce qui concerne les ERFs, certains sont connus pour leur implication dans la synthèse de cire épicuticulaire en condition naturelle: WXP1/2, WIN1, et SHN. Leur surexpression a donc pour conséquence une augmentation de la cire (Aharoni et al., 2004; Broun et al., 2004; Zhang et al., 2007).

Pour l’ensemble des autres phénotypes liés au développement causés par la surexpression de DREB ou ERF, la question reste ouverte.

Des réponses peuvent être apportées en comparant les caractéristiques de la plante transgénique avec une plante en condition de stress, comme une plante acclimatée au froid par exemple. Ce type d’approche a permis de montrer que l’augmentation de l’épaisseur des feuilles observée chez les pommes de terre surexprimant le gène AtCBF1 pouvait être impliquée dans la tolérance au froid chez ce végétal (Pino et al., 2008).

GA DELLA

GID1 Destruction DELLA

GA

non active _active GA

GA20ox GA3ox GA2ox Croissance Floraison CBF _{Accumulation de} GA

non active _DELLA

Figure II-1 : Hypothèse sur l’implication des CBFs dans la voie de biosynthèse des gibbérellines proposée par Achard et ses collaborateurs.

Les GAs actives sont capables de former un complexe avec les protéines DELLA et GID1, ce qui entraîne la destruction des DELLAs. Les CBFs seraient des activateurs de l’enzyme GA2ox qui est impliquée dans l’inactivation des GAs. Non actives, les GAs ne sont plus capables de se lier aux DELLAs, dont l’accumulation sous forme libre inhibe la croissance et la floraison. De ce fait, lors de la surexpression d’un gène CBF, les plantes transgéniques présentent un phénotype nain.

Chapitre 2 - Surexpression des gènes EguCBF1a ou 1b chez E. urophylla x E. grandis et Arabidopsis thaliana

Une autre façon de confirmer l’implication du facteur de transcription dans le phénotype observé est d’analyser des lignées RNAi de ce gène dans lesquelles on peut s’attendre au phénotype inverse. Mais aucune étude de ce type n’a été encore mise en œuvre sur les DREB ou ERF. Seules des lignées RNAi AtCBF1, 2 ou 3 ont été étudiées et uniquement au niveau de la tolérance au froid et des gènes cibles induits (Novillo et al., 2007).

Finalement, les études encore limitées sur le rôle des DREB et ERF dans le développement, n’ont pas encore pu prouver de lien entre ces facteurs et la densité des stomates, la taille des feuilles ou des cellules. Par ailleurs, le retard de croissance a fait l’objet de plus d’attention, certainement parce qu’il représente un frein pour l’amélioration des plantes cultivées.

La surexpression d’un gène CBF entraîne un retard de croissance dans la plupart des cas. Si on analyse les situations où le retard de croissance n’est pas noté on s’aperçoit qu’il s’agit d’un gène isolé chez une monocotylédone surexprimé chez une dicotylédone, ou inversement (annexe 2). Ceci suggère que l’implication des CBFs dans le développement est différente entre monocotylédone et dicotylédone ou bien que les CBFs de monocotylédones ne sont pas pleinement efficaces lorsqu’ils sont exprimés chez une dicotylédone, et inversement. Ce constat a été fait par Shen et ses collaborateurs qui ont noté un retard de croissance lorsque le gène TaDREB1 (isolé chez Triticum aestivum) est surexprimé chez Oriza sativa et aucune modification de la croissance lorsqu’il est surexprimé chez A. thaliana (Shen et al., 2003).

De plus, Wang et al. ont montré que la sévérité du retard de croissance est liée à la capacité de transactivation d’AtCBF1 (Wang et al., 2005).

Il semble donc que le retard de croissance causé par la surexpression d’un gène CBF soit lié à une implication de ces facteurs dans le contrôle de la croissance. Ce retard est, lorsque cela a été tenté, supprimé par l’ajout de gibbérelline. Ces résultats ont mené vers la piste d’un rôle des CBFs dans la voie de régulation des gibbérellines. Récemment, Achard et al. ont posé l’hypothèse selon laquelle les CBFs régulent de manière positive le gène de la GA2 oxydase impliqué dans l’inactivation des GAs (Fig.II-1). Les GAs inactives n’interagissent plus avec les protéines de la famille des DELLAs qui s’accumulent et inhibent la croissance. L’ajout de GA3 sur les lignées Arabidopsis naines surexprimant le CBF, permet de retrouver le phénotype sauvage (Achard et al., 2008).

Chapitre 2 - Surexpression des gènes EguCBF1a ou 1b chez E. urophylla x E. grandis et Arabidopsis thaliana

Après avoir prouvé l’importance des DREB et ERF dans la tolérance au stress, leur implication dans le développement commence à se préciser et particulièrement en relation avec les CBFs qui sont les plus étudiés. En effet, les phénotypes observés lors de surexpression et les récentes données d’Achard et al. renforcent l’idée qu’un lien existe entre CBF et développement.

Dans le premier chapitre, après avoir mis en évidence une régulation différentielle entre les gènes de facteurs de transcription CBFs au cours de la réponse au froid, une question restait en suspend: les CBFs sont-ils fonctionnels ? L’analyse fonctionnelle des CBFs chez des lignées transgéniques d’Eucalyptus a été menée pour répondre à ce questionnement.

Ce deuxième chapitre présente donc l’obtention et l’analyse de lignées d’E.urophylla x E. grandis surexprimant les gènes EguCBF1a ou 1b en culture in vitro ainsi que l’obtention d’A. thaliana surexprimant ces mêmes gènes.

Après l’évaluation de la tolérance au gel des lignées transgéniques, l’analyse morphologique a été approfondie pour tenter d’apporter de nouveaux éléments dans la compréhension du rôle des EguCBF1s dans le développement.

L’effet de chacun des deux EguCBF1s sur la tolérance au gel et le développement est comparé.

En parallèle, la surexpression chez A. thaliana permet d’avoir des éléments de comparaison avec les nombreux travaux qui analysent la surexpression chez ce même fond génétique de gènes CBFs isolés chez de nombreuses espèces.

Cal (Fond clair) Visualisation de la GFP

5 jours à l’obscurité puis 5 à 10 jours sur un milieu

sélectif (BITAugK)

Après environ un mois sur milieu sélectif (BITAugK)

E. urophylla x E. grandis

Mise en culture sur un milieu non sélectif (SDM)

15 jrs _{1 mois}

12 jrs

Infiltration par des agrobactéries contenant le vecteur d’expression

≈ 2 mm

Multiplication Fond clair Visualisation de la GFP

Lignée transformée surexprimant un CBF

Figure II-2 : Les grandes étapes de la transformation génétique d’E. urophylla x E.

grandis par Agrobacterium tumefaciens (AGL1).

Des demi-feuilles d’E. urophylla x E. grandis sont mises en contact avec des agrobactéries contenant le vecteur d’expression. Ces explants sont mis en culture sur une succession de milieux (annexes 8-11) conduisant à la régénération de bourgeons transformés qui sont ensuite isolés et multipliés afin d’obtenir des lignées d’Eucalyptus transgéniques stables.

Chapitre 2 - Surexpression des gènes EguCBF1a ou 1b chez E. urophylla x E. grandis et Arabidopsis thaliana

II. Surexpression des gènes EguCBF1a ou 1b chez E. urophylla x E.