Obtention des lignées transformées

Afin de déterminer si les EguCBF1a et EguCBF1b sont fonctionnels leur surexpression chez E. urophylla x E. grandis a été réalisée par agroinflitration. Le vecteur utilisé présente un ADN-T qui comprend notamment: le gène de résistance à la kanamycine, le gène de la eGFP (Enhanced Green Fluorescent Protein) et l’ORF du gène d’intérêt sous le contrôle d’un promoteur 35SCaMV. En parallèle, la transformation d’E. urophylla x E. grandis par un vecteur vide a été menée pour générer la lignée contrôle.

La figure II-2 présente les grandes étapes de la transformation in vitro de l’E. urophylla x E. grandis par Agrobacterium tumefaciens, mise au point dans l’équipe (Tournier et al., 2003). Les bactéries sont mises en contact avec des morceaux de feuilles d’E. urophylla x E. grandis pendant 5 jours à l’obscurité. Après cette coculture, certaines cellules fluorescent en vert lorsqu’elles sont éclairée en lumière bleue grâce à l’expression du gène de la GFP. Les cals formés sur les feuilles après une dizaine de jours, portant des évènements de transformation (secteurs GFP) sont sélectionnés, puis transférés sur un milieu favorisant la régénération. Après trois mois, parmi les bourgeons développés sur les cals, ceux apparaissant fluorescents en lumière bleue sont isolés, puis mis en culture sur un milieu qui permet leur multiplication. Après quelques mois, le bourgeon multiplié devient une lignée transformée référencée que l’on peut maintenir.

L’évolution de la transformation est suivie tous les 15 jours pendant les 3 premiers mois puis environ tous les mois pendant 8 à 11 mois afin de contrôler l’évolution des cals puis des bourgeons transformés. Quinze jours après la transformation, l’efficacité de transformation est évaluée en comptant les cals exprimant la GFP. Après 3 mois, le nombre de bourgeons (transformés ou non) sur chaque cal est compté pour évaluer le taux de régénération.

L’ensemble de ces données est présenté dans le tableau II-1.

Tableau II-1 : Efficacité des trois transformations d’E. urophylla x E. grandis. EguCBF surexprimé Nombre d'explants au départ de la transformation Efficacité de transformation (%) (1) Nombre d'explants 3 mois après la transformation Taux de régénération (2) Nombre de bourgeons GFP+ isolés Pourcentage de bourgeons transformés (%)(3) Efficacité finale de transformation (%) (4) 1a 640 43,7 ± 14,4 336 2,8 ± 1,8 32 3,4 5 (9.5) 1b 920 43,1 ± 12,3 156 2,6 ± 1,8 14 3,5 1.5 (8.9) vide 400 53,4 ± 13,4 198 4,9 ± 2,2 3 nd nd

(1) (nombre de cals avec secteurs GFP+/ nombre de cals total x 100), 10 à 15 jours après la transformation.

(2) nombre moyen de bourgeons / explants, 3 mois environ après la transformation.

(3) (nombre de bourgeons GFP+ / (taux de régénération x nombre d’explants 3 mois après la transformation) x 100).

Chapitre 2 - Surexpression des gènes EguCBF1a ou 1b chez E. urophylla x E. grandis et Arabidopsis thaliana

II.1.1. Efficacité de transformation

Elle est calculée en faisant le rapport entre le nombre de cals présentant des événements de transformation (« points verts » en lumière bleue), 10 à 15 jours après la transformation, et le nombre total d’explants. On constate que l’on obtient une efficacité de transformation proche de 40% pour les trois transformations (1a, 1b, et vecteur vide). L’écart type assez élevé peut être dû à l’état des bactéries plus ou moins virulentes malgré une DO toujours identique entre les transformations, et/ou aux variations du stade de développement des feuilles même si les explants ont le même âge (2.5 semaines après le repiquage).

II.1.2. Taux de régénération et pourcentage de bourgeons transformés (GFP+₎

Le taux de régénération est une moyenne du nombre de bourgeons régénérés (transformés ou non) par explant, trois mois après la transformation. En considérant les écart- types, les trois séries de transformations présentent des taux comparables d’environ 2.5 bourgeons par explant.

Sur la totalité des bourgeons, 32 sont transformés pour la surexpression du gène EguCBF1a, 14 pour le gène EguCBF1b, et 3 pour le vecteur vide. Le pourcentage de bourgeons transformés est calculé comme suit : nombre de bourgeons transformés/(nombre d’explants 3 mois après transformation x % de régénération)x100. Ici le nombre d’explants après 3 mois est pris en compte au lieu du nombre d’explants de départ car entre ces deux temps beaucoup d’explants ont été éliminés, suite à des contaminations, en particulier pour la surexpression du gène EguCBF1b. D’autre part, les explants sont mis en culture pendant 2 mois sur un milieu sélectif (BITAugK) qui induit la formation de bourgeons et la mort des explants non transformés. Les explants sont ensuite transférés sur un milieu non sélectif (SDM) qui favorise le développement des bourgeons. Ainsi, le nombre d’explants après 3 mois a diminué d’environ 50% pour la surexpression du gène EguCBF1a et pour le vecteur vide, ce qui correspond au pourcentage de transformation.

Le pourcentage de bourgeons transformés calculé pour la surexpression des gènes EguCBF1a et EguCBF1b est quasi identique (3.5%). Celui du vecteur vide n’a pas été déterminé car après avoir obtenu trois bourgeons transformés, le reste des bourgeons n’a pas été analysé.

Chapitre 2 - Surexpression des gènes EguCBF1a ou 1b chez E. urophylla x E. grandis et Arabidopsis thaliana

Environ 3.5% de bourgeons transformés semble un taux faible mais qui peut s’expliquer par le second milieu utilisé (SDM) ne contenant pas de kanamycine car il a été impossible de déterminer une concentration en kanamycine pour une sélection sans impact sur la régénération. De ce fait, le milieu utilisé a entrainé de nombreux faux positifs.

II.1.3. Efficacité finale de transformation

Elle est calculée en rapportant le nombre de bourgeons transformés au nombre d’explants au départ de la transformation. Pour la surexpression du gène EguCBF1a elle est de 5% alors que pour celle du gène EguCBF1b elle est seulement de 1.5%. Cette différence est uniquement due aux contaminations qui ont engendré la perte de nombreux explants. Si le calcul de l’efficacité de transformation est fait par rapport au nombre d’explants après 3 mois, il est très proche entre la surexpression du gène EguCBF1a et celle du gène EguCBF1b (9.5 et 8.9 %). Nous considérerons donc l’efficacité de transformation avec le vecteur EguCBF1a qui est de 5%, c'est-à-dire deux fois plus faible que celle obtenue par Tournier et al (Tournier et al., 2003). Dans ces premiers travaux, les conditions de transformation avaient été optimisées à un génotype particulier de l’hybride E. grandis x E. urophylla (hybride inverse de celui utilisé ici). Cependant, ce résultat est tout à fait satisfaisant pour un ligneux, en comparaison de l’efficacité de transformation du peuplier et du citronnier comprises respectivement entre 2 et 12% et 7.6 et 11.2% (Song et al., 2006; de Oliveira et al., 2008).

Un an et demi après les premières expériences de transformation, 32 lignées surexprimant le gène EguCBF1a, 14 surexprimant le gène EguCBF1b et 3 lignées portant le vecteur vide (pK7) ont été obtenues. Après vérification de la présence de l’insert par PCR, ces lignées ont été analysées et sélectionnées sur le niveau d’expression du transgène et la tolérance intrinsèque au froid.

II.2. Sélection de la lignée contrôle, de 3 lignées surexprimant le gène