Analyse d’expression

III.1. Extraction d’ARN

Les ARNs totaux sont extraits à partir de 100mg de feuilles broyées dans l’azote liquide en utilisant le kit « SV Total RNA Isolation System » de Promega. Pour les feuilles récoltées sur des arbres au champ qui sont riches en polyphénols et polysaccharides, le tampon de lyse fourni dans le kit est remplacé par un tampon décrit par Jones (Jones et al., 1985). De plus, les étapes de lavage des colonnes sont répétées au minimum 3 fois.

Le kit comprend un traitement DNase sur colonne de 15 minutes, cette étape est prolongée à 30 minutes si les ARNs sont destinés aux analyses en RTqPCR.

Les ARNs sont dosés à l’aide du spectrophotomètre ND-1000 de NanoDrop (Wilmington, De, USA) et leur qualité est vérifiée sur gel d’agarose à 1% dans TAE 0.5X.

III.2. RTqPCR

III.2.1. Synthèse d’ADNc

Elle est réalisée dans un mélange réactionnel de 25µl contenant : 3µg d’ARN, 1.7µl d’amorces aléatoires Random Primer (Invitrogen, Carlsbad, USA) à 3µg/µl, 1µl de dNTPs à 10mM, 0.7µl de RNAsin à 40U/µl (Promega, Madison, WI, USA), et 1µl d’enzyme polymérase Superscript II Reverse Transcriptase à 200U/µl (Invitrogen, Carlsbad, USA). Le premier brin d’ADNc est synthétisé à 42°C.

Afin de vérifier que les ADNc ne sont pas contaminés par de l’ADN génomique, l’amplification du gène de la tubuline de E.globulus contenant un intron est réalisée.

Enfin les ADNc sont dosés à l’aide du spectrophotomètre ND-1000 de NanoDrop (Wilmington, De, USA).

III.2.2. Amplification en temps réel

Les réactions PCR sont réalisées 3 fois pour chaque échantillon dans un volume réactionnel de 10µl. Le mix PCR contient du Power SYBR Green PCR Master Mix (2X) d’Applied Biosystems (Foster City, CA, USA), des amorces spécifiques à 300 nM, et de l’ADNc dont la quantité dépend du couple d’amorces utilisé. Les amorces utilisées sont

Pour chaque gène étudié :

1- Clonage de la séquence du gène où les amorces spécifiques sont désignées. 2- Calcul du nombre de copies/µl de la solution mère de plasmide :

On sait qu’un nucléotide = 660 Da Taille du plasmide en pb x 660 = y Da soit y g/mol

avec C = concentration en g/l de la solution mère de plasmide

C/y = A en mol/l

Or 1mol = 6.023 x 1023 _{molécules (nombre d’Avogadro)} Donc A x 6.023x1023_{= B en nombre de copies/l}

3- Dilution de la solution mère de plasmide (B) pour obtenir une gamme étalon de 108 à 10 copies de plasmide.

4- PCR avec les amorces spécifiques du gène sur la gamme étalon.

5- Obtention de la courbe étalon (exemple de celle correspondant à EguCBF1b)

6- Report du Ct sur la courbe étalon pour déterminer le nombre de copies d’EguCBF1b

Figure m&m-3 : Exemple de détermination du nombre de copies de transcrits pour EguCBF1b.

A : courbe étalon brute. B : courbe étalon après avoir converti les valeurs en log10. Seule la gamme entre 10 et 106 _{est utilisée car les valeurs de Ct obtenues avec les transcrits EguCBFs sont toujours supérieures à 15.}

La gamme étalon permet de déterminer le nombre de copies de transcrits du gène étudié qui est ensuite ramené à 1ng d’ADNc. EguCBF1b 0 5 10 15 20 25 30 35 10 100 103 ₁₀4 ₁₀5 ₁₀6 ₁₀7 ₁₀8 Valeur s de C t A Log10

Nombre de copies du plasmide

EguCBF1b y = -0,0621x + 1,5829 1 1,1 1,2 1,3 1,4 1,5 1,6 1 2 3 4 5 6 Valeur s de Ct (L og10)

Nombre de copies du plasmide (Log10) B

Matériel et Méthodes

désignées dans la majorité des cas dans la partie 3’UTR du gène avec le logiciel PRIMER EXPRESS 2.0 d’Applied Biosystem (Courtaboeuf, France). Les amorces utilisées pour détecter le niveau de transgène sont désignées dans la partie codante. L’ensemble des amorces ainsi que les quantités d’ADNc optimum correspondantes sont présentés dans l’annexe 4.

III.2.3. Interprétation des résultats

Deux types de calculs ont été effectués. Dans les deux cas les données brutes sont analysées avec le logiciel SDS 2.2 d’Applied Biosystem en intégrant l’analyse des courbes de dissociation.

Le premier calcul vise à déterminer le niveau d’induction par rapport à une situation de contrôle. Ici, il s’agit de comparer le plus souvent l’expression d’un gène en condition de stress froid à celle en condition non stressante (23°C). Pour obtenir cette valeur d’induction la méthode du 2-ΔΔCt est appliquée (Livak and Schmittgen, 2001). Le gène de référence utilisé est le 18S dont le Ct est constant dans tous les types de stress étudiés.

Le second calcul permet de définir le nombre de copies de transcrits correspondant au gène d’intérêt par ng d’ADNc. Pour parvenir à cette valeur, il faut tout d’abord établir une courbe étalon qui exprime le nombre de copies de transcrits en fonction des Ct pour chaque couple d’amorces utilisé. Pour cela, une solution plasmidique contenant la partie du gène où les amorces sont désignées, est utilisée pour préparer des dilutions de 108 à 10 copies de plasmide. La concentration de la solution, la taille du plasmide ainsi que le nombre d’Avogadro sont nécessaires pour déterminer ce nombre de copies (Fig m&m-3). Chacune des dilutions est alors amplifiée comme décrit ci-dessus, pour déterminer la valeur de Ct correspondant à un nombre de copies de transcrits donné. La courbe étalon Ct=f(nombre de copies de transcrits) est alors tracée (Fig m&m-3A). L’amplification en temps réel étant exponentielle, les valeurs sont converties en log de 10 pour obtenir une droite (Fig m&m-3B) et calculer le coefficient directeur correspondant.

Il reste ensuite à reporter les valeurs de Ct obtenues lors d’un stress pour connaitre les nombres de copies de transcrits pour un gène à un instant précis et le ramener à 1ng d’ADNc.

P1 P2 B1

B1

Figure m&m-4 : Schéma du principe de la technique Gateway (Invitrogen).

La séquence d’intérêt est amplifiée par PCR et des adaptateurs B1 et B2 sont ajoutés à chaque extrémité. Le produit PCR ainsi obtenu est inséré dans le vecteur donneur (pDNOR) par l’action enzymatique de la BP clonase. Le vecteur d’entrée est ensuite combiné au vecteur de destination grâce à la LR clonase pour obtenir le vecteur d’expression. Enfin celui-ci est inséré dans des agrobactéries utilisées pour la transformation des microboutures d’E. urophylla x E. grandis.

B2 Gene B2 L2 Vecteur d’entrée L1 B2 Vecteur d’expression B1 Gene Produit PCR

+

Matériel et Méthodes

IV. Surexpression du gène EguCBF1a ou 1b chez l’E. urophylla x E.