Structure du site actif

La structure cristallographique du domaine oxygénase a pu être obtenue entre autres pour iNOSoxy de souris [93, 94], iNOS humaine [72, 73], eNOS bovine [71], eNOS humaine [71] et nNOS bovine [95, 96].

Positionnement de l’hème :

Le domaine iNOSoxy murin est constitué par les acides aminés 66 à 498 (82 à 508 pour la iNOS humaine). L'hème de iNOS de souris est pris en sandwich entre deux résidus aromatiques : le tryptophane Trp 188 et la phénylalanine Phe 363 (Trp 194 et Phe 369 pour iNOS humaine) situés de part et d'autre de la porphyrine.

Figure 16 : Structure du site actif de la NOS inductible murine (iNOS). L’hème est en rouge, l’arginine en jaune et le BH4 en vert.

Le fer de l'hème a pour ligand proximal l'atome de soufre d’une cystéine en position 194 (iNOS murine, Figure 16). Cette cystéine effectue une liaison H primordiale pour le mécanisme moléculaire de la protéine avec le résidu tryptophane Trp 188 (iNOS murine).

Positionnement du substrat :

La dimérisation permet de créer une cavité pour le site actif de 10 Å × 15 Å, au bout d’un canal d’accès de 30 Å environ [94] qui permet ainsi la diffusion de l'arginine, du NOHA et de la citrulline. Le groupement guanidinium de l'arginine est pointé vers l'hème. Dans le cas de iNOS de souris le groupement guanidinium de l'arginine forme une liaison H avec le tryptophane Trp 366 [94] et avec une molécule d’eau très conservée parmi les différentes structures de NOS. L’extrémité amino-acide de l’arginine est également maintenue rigoureusement par les liaisons H que la partie acide carboxylique établit avec les chaînes latérales des résidus glutamine (Gln 257), tyrosine (Tyr 367) et acide aspartique (Asp 376) (Figure 16). Le positionnement du NOHA semble impliquer le même type de réseau de liaisons H [97].

Positionnement du cofacteur :

Le BH4 est fixé grâce à des interactions d’empilement  situés de part et d’autre du noyau ptérine : le cycle aromatique indole d'un tryptophane (Trp 467 dans la numérotation de iNOS de souris) d’un coté et un résidu phénylalanine (Phe 470) de l’autre (Figure 16). Le groupement amide de BH4 effectue une liaison H directement avec un groupement propionate de l’hème, cette dernière interaction serait un élément clef pour le rôle redox du cofacteur dans le mécanisme moléculaire de la NOS [97].

Très peu de différences ont été observées concernant la structure du site catalytique entre les différents isoformes [72, 73]. L'ensemble du site actif forme un réseau de liaisons H dense impliquant substrat, hème, cofacteur, résidus de la poche, molécules d'eau [94, 97, 98]. Cela permet de maintenir une certaine rigidité au système, de garantir la spécificité de substrat, de maitriser les processus de transfert de proton et d'électron. La moindre modification de ce réseau aura des conséquences importantes sur le mécanisme moléculaire de la protéine.

Cas des NOS bactériennes :

Les premières structures cristallographiques de NOS bactériennes furent celles de Deinococcus radiodurans [68] et de Bacillus subtilis [90] suivies ensuite par la NOS de Staphylococcus aureus (saNOS, [91]), stNOS [48] et enfin la NOS de Geobacillus stearothemophilus (gsNOS, [99]) et baNOS [100, 101].

Toutes ces protéines ont une structure très similaire et superposable à celle des NOS de mammifère [71, 72, 93, 94]. Le site actif est très conservé.

Comme pour la NOS de mammifère, le fer de l'hème a pour ligand proximal l'atome de soufre d’une cystéine (Cys 72 dans le cas de bsNOS [59]). La liaison H entre la cystéine et le résidu tryptophane est conservée (Trp 66 dans le cas de bsNOS [59]) ainsi que les interactions d’empilement  entre ce tryptophane et la porphyrine. La liaison proximale entre le fer et le soufre est légèrement plus forte chez la NOS bactérienne [102]. Mais les réels effets du renforcement de cette liaison n’ont jamais été approfondis.

Les substrats arginine et NOHA s'orientent avec leurs groupements guanidinium et hydroxy- guanidinium dirigés vers l’hème et stabilisés dans cette position grâce à différentes liaisons H avec les acides aminés de la cavité du substrat.

Les sites actifs des NOS bactériennes diffèrent uniquement des NOS de mammifère sur un acide aminé adjacent à l’atome de fer : une Valine de la NOS de mammifère est remplacée par une Isoleucine dans le cas de la NOS bactérienne [90, 103]. gsNOS, qui a la spécificité d'être thermorésistante, présente une différence supplémentaire : la lysine (Lys 356) de bsNOS est remplacée par une arginine (Arg 365 dans le cas de gsNOS). Cela réorganise subtilement la position des acides aminés de la poche distale et le résidu Isoleucine se retrouve plus proche encore de l’hème. La poche est plus restreinte et cela stabilise les intermédiaires réactionnels et ralenti les réactions de dissociation fer-ligands quelque soit la température [99].

L’absence de la boucle N-Terminale permet la fixation d'un cofacteur de plus grande taille moléculaire [68, 90]. La plupart des eucaryotes qui ont un gène de NOS, détiennent également les gènes nécessaires à la biosynthèse de BH4. Chez les procaryotes, seuls les bacilles ont les gènes de la sepiaptérine réductase, enzyme de la dernière étape de la synthèse de BH4. Par contre tous ces organismes sont capables de produire le tétrahydrofolate (THF). Le THF est constitué d’un noyau ptérine et d’une chaine latérale beaucoup plus large que celle de BH4 ce qui expliquerait que les NOS bactériennes, dont le site de fixation est beaucoup plus ouvert, seraient capables d’utiliser ce cofacteur [68] (Figure 17).

Figure 17 : Formules chimiques des cofacteurs BH4 et THF.

drNOS [68, 104] mais pas nécessairement pour bsNOS qui est munie de la sepiaptérine réductase et fixe mieux BH₄ que THF.

Le site catalytique de la NOS bactérienne est très semblable à celui de la NOS de mammifère ce qui justifie que la NOS bactérienne soit un modèle courant pour étudier la NOS de mammifère. En revanche le site de fixation du cofacteur est différent. La NOS bactérienne est capable de fixer les cofacteurs BH₄ et THF. Mais, contrairement aux NOS de mammifères, ceux-ci ne sont pas indispensables à la stabilité du dimère. Bien que la synthèse de NO soit rendue possible en leurs présences, le rôle redox de ces cofacteurs dans le mécanisme moléculaire de la NOS bactérienne n'a jamais été démontré.