Effet de la mutation sur l’équilibre haut spin – bas spin

L'expression et la purification des protéines mutantes ont permis d'obtenir de 10 à 20 mg de protéine par litre de culture à l'exception du mutant W66A (voir Chapitre 2, 1.3.). Ce dernier n'a pas pu être purifié en grande quantité et de manière stable prouvant que la mutation alanine déstructure significativement l'environnement proximal du site actif. Elle ne permet plus l'incorporation de l'hème, la dimérisation et altère la stabilité globale de la protéine. Ce mutant n'a donc pas pu être étudié. Cet effet avait déjà été observé dans le cas des mammifères avec les mutants iNOS W188F et nNOS W409L qui se sont avérés également incapables d'incorporer l'hème [182, 196, 214, 215]

Etude de l’espèce FeIII _{en absence de substrat et de cofacteur :}

Afin de connaître l'effet de la mutation sur l'état de coordination du fer, les mutants qui ont pu être purifiés ont d'abord été analysés par spectroscopie UV-Visible et par spectroscopie RPE a l'état FeIII _{sans substrat ni cofacteur.}

300 400 500 600 700 Longueur d'onde (nm) W66F W66L W66Y W66H WT

Figure 54 : Spectres UV-Visible de bsNOS sauvage et des mutants W66 H, F, Y et L à l'état FeIII _{en absence de cofacteur et de substrat.}

En absorption électronique (Figure 54), la protéine sauvage et le mutant W66H, sans substrat, ont des spectres caractéristiques d'une protéine presque totalement à l'état FeIII _HS-5C (bande de Soret à 396 nm). Les mutants F, Y et L ont tous un spectre ayant un épaulement aux alentours de 417 nm suggérant la présence d'une fraction de protéine à l'état FeIII _BS-6C.

En spectroscopie RPE (voir Chapitre 2, 4.4.), la signature spectrale de la protéine bsNOS sauvage sans substrat met en évidence la présence de 2 espèces. La première (majoritaire) correspond à un fer à l'état FeIII _{HS-5C caractérisé par 3 valeurs de g}

eff; la seconde espèce (très minoritaire) est un FeIII _{BS-6C (Figure 55).}

0 100 200 300 400 500 g_3eff g_2eff g_1eff W66L W66Y W66F W66H WT Champ magnétique (mT) FeIII _HS,

sans substrat, sans cofacteur

E/D E strain

(% de E)

g1eff g2eff g3eff

WT 0,074 15 7,59 4,22 1,83

W66H 0,076 18 7,63 4,18 1,82

W66Y 0,088 30 7,84 3,91 1,77

W66F 0,091 21 7,89 3,84 1,75

W66L 0,104 19 8,09 3,57 1,69

Figure 55 : Spectres RPE en bande X à 10 K de bsNOS et des mutants H, F, Y et L à l'état FeIII _en

absence de cofacteur et de substrat (en noir) et simulations (en bleu).

Tableau 3 : Valeurs de geff du FeIII HS sans substrat et

Tout comme en UV-Visible, les mutants W66F et W66Y montrent une plus grande proportion d'espèces BS contrairement à la protéine sauvage et au mutant W66H. Cette différence suggère que la suppression de la liaison H engendrée par les mutations F et Y, en absence du substrat, a un effet direct sur la coordination et l'état de spin du fer et sur la structuration du site actif. Elle favorise la fixation d'une molécule d'eau sur le fer et l'adoption de la configuration bas spin. De manière surprenante, la mutation qui modifie le plus l'environnement proximal (la mutation L) a une proportion d'espèce BS relativement faible comparée aux autres mutants.

La simulation des signaux FeIII _{prend en compte l'effet Zeeman et l'éclatement en champ nul} caractérisé par les paramètres D et E (voir Chapitre 2, 4.4.2.). En absence de substrat la valeur E/D augmente dans l'ordre WT<W66H<W66Y<W66F<W66L et permet de distinguer deux groupes : les signaux RPE du FeIII _{HS de la protéine sauvage et du mutant W66H sont moins anisotropes que} ceux obtenus avec les mutants W66Y, W66F et W66L (Tableau 3).

L'étude de l'espèce minoritaire FeIII _{BS permet de confirmer la constitution des deux groupes} définis d'après l'étude de l'espèce FeIII _{HS. Les Fe}III _{BS de la protéine sauvage et du W66H sont} similaires et les mutants F et Y ont une plus faible anisotropie de g pour cette espèce (Figure 56, Tableau 4). 260 280 300 320 340 360 380 400 W66F W66Y Champ magnétique (mT) WT W66H g₃ g₂ g₁ FeIII _BS,

sans substrat, sans cofacteur

g1 g2 g3 giso g (H strain en MHz) _ WT 2,45 (500) 2,29 (0) 1,90 (200) 2,21 0,55 W66H 2,45 (450) 2,29 (0) 1,90 (157) 2,21 0,55 W66Y 2,41 (360) 2,27 (0) 1,93 (103) 2,20 0,48 W66F 2,39 (260) 2,27 (0) 1,93 (77) 2,20 0,46

Figure 56 : Spectres RPE en bande X à 10 K du FeIII

BS de bsNOS sauvage et des mutants H, F et Y en absence de cofacteur et de substrat (en noir) et simulations (en bleu).

Tableau 4 : Valeurs de g du FeIII _{BS sans substrat et sans}

cofacteur.

Rôle du substrat sur la transition FeIII_{BS  Fe}III_{HS :}

de l'hème des mutants ont été étudiées par spectroscopie UV-visible et RPE en présence du substrat arginine. Ce dernier a pour effet d'augmenter drastiquement l'homogénéité structurale de la protéine.

300 400 500 600 700 Longueur d'onde (nm) W66F W66L W66Y W66H WT 0 100 200 300 400 500 W66L W66F W66Y WT W66H Champ magnétique (mT) g_3eff g_2eff g_1eff

Figure 57 : Spectres UV-Visible de bsNOS sauvage et des mutants H, F, Y et L à l'état FeIII _{et en présence du}

cofacteur et du substrat arginine.

Figure 58 : Spectres RPE en bande X à 10 K de bsNOS sauvage et des mutants H, F, Y et L à l'état FeIII _{en absence de cofacteur et en présence du}

substrat arginine (en noir) et simulations (en bleu).

En présence d'arginine les spectres UV-Visible et RPE sont uniquement constitués d'un signal HS-5C et ceci pour tous les mutants (Figure 57 et Figure 58, spectres noirs). L'ajout de l'arginine permet d'obtenir des spectres UV-visible ayant une bande de Soret aux alentours de 396 nm pour les cinq protéines étudiées (Tableau 5). En spectroscopie RPE on observe des raies de résonance plus fines et l'anisotropie du signal évolue dans le sens W66H<WT< W66Y<W66F<W66L (Tableau 5).

Soret, avec Arg

RPE FeIII _HS,

avec Arg

 max (nm) E/D E strain

(% de E)

g1eff g2eff g3eff

WT 396 0,080 15 7,70 4,09 1,80

W66H 395 0,077 19 7,65 4,15 1,82

W66Y 396 0,090 11 7,87 3,86 1,75

W66F 396 0,094 12 7,93 3,78 1,74

W66L 396 0,105 14 8,10 3,55 1,68

Tableau 5 : Valeurs de la bande de Soret, valeurs de geff et rapport E/D du FeIII HS de

Ces résultats montrent que tous les mutants sont capables de fixer le substrat. Celui-ci induit une meilleure structuration du site actif et la configuration FeIII _{HS-5C est adoptée. Cet effet est} exacerbé pour les mutants F et Y qui avaient une plus grande proportion d'espèce BS en absence de substrat.

Conclusion de l’étude de l’espèce FeIII _:

En conclusion de l'étude de l'état FeIII _{de la protéine, nous pouvons noter que les mutants} arrivent à incorporer l'hème et à se structurer malgré la modification de l'environnement proximal de l'hème (à l'exception du mutant W66A). Ils sont tous capables de fixer le substrat comme le prouve la transition électronique BS→HS en présence de celui-ci.

Les études en spectroscopie UV-visible et RPE aboutissent à la distinction de deux groupes corrélés à la présence ou non d'une liaison H forte entre le résidu 66 et la cystéine en liaison proximale du fer. Le mutant histidine, qui maintient la liaison H, garde des propriétés

électroniques proches de la protéine sauvage : même état de spin, même coordination, signatures spectrales similaires. Les mutants F, Y et L (qui rompent cette liaison H) induisent des modifications structurales et électroniques plus importantes.

1.3. Effet de la mutation sur l’effet push