CHAPITRE 2 Matériels et méthodes
4. Techniques spectroscopiques utilisées pour l'étude des différents complexes de NOS
4.2. La spectroscopie de Raman de résonance
Dans le cadre de ma thèse la spectroscopie Raman de résonance (RR) a été utilisée pour l’étude des complexes héminiques préparés avec les protéines bsNOS mutées (Chapitre 3.1.). Elle a été utilisée également pour l’analyse des échantillons cryo-réduits (Chapitre 4).
4.2.1. Quelques généralités sur la spectroscopie de Raman de résonance La diffusion Raman :
Quand un faisceau de lumière traverse un échantillon, elle est propagée, réfléchie, absorbée, transmise, et également diffusée. La diffusion de la lumière se fait majoritairement de manière élastique c’est-à-dire avec une longueur d’onde diff du photon diffusé égale à la longueur d’onde 0 du photon incident : c’est le phénomène de diffusion Rayleigh (diff = 0). Cependant une faible fraction de la lumière est diffusée de manière inélastique (diff ≠ 0) et contient l’information vibrationnelle caractéristique de l’énergie des sous-niveaux vibrationnels de la molécule (vib) : c’est la diffusion Raman.
Maximum d’absorption de la bande de Soret (max en nm)
iNOSoxy bsNOS FeIII (LS) 420 398 FeIII +BH4 (LS+HS) 400-402 398 FeIII + BH4 + Arg (HS) 395 394 FeII + BH4 + Arg 412 412 FeIIINO + BH4 + Arg 440 440 FeIINO + BH4 + Arg 436 436 FeIICO + BH4 + Arg 445 446
L'effet de résonance :
La spectroscopie Raman de résonance est un cas particulier de la spectroscopie Raman, qui permet l’étude sélective d’un chromophore. Ce phénomène de résonance se produit lorsque la longueur d’onde d’excitation correspond à une transition électronique permise du chromophore d’intérêt. Il y a alors amplification de l’effet Raman, jusqu'a × 106 : c’est l’effet Raman de résonance. Les transitions électroniques permises de la molécule sont détectées au moyen du spectre d’absorption UV-visible de la molécule. Expérimentalement, on choisit une longueur d’onde d’excitation proche d’un maximum d’absorption UV-visible de la molécule à étudier.
Vont être observés en spectroscopie Raman de résonance les modes vibrationnels simples dans le plan et les modes de vibrations plus complexes qui se situent en dehors du plan. Dans le plan, on distingue l’élongation () et la déformation angulaire () qui peuvent être symétriques (s et
s), ou antisymétriques (as et as) (Figure 35). Ils se traduisent, respectivement, par des mouvements de cisaillement et de rotation. Hors du plan moléculaire, il s’agit de déformations angulaires symétrique (s) ou antisymétrique (as), et qui correspondent à des mouvements de torsion ou de balancement (Figure 35).
Figure 35 : Représentation des mouvements moléculaires correspondants aux modes de vibrations dans le plan et hors du plan de la molécule. Exemple d’une molécule triatomique non linéaire (H2O).
Les modes de vibrations peuvent se combiner et donner différentes bandes Raman qui ne correspondent pas à des modes purs. Une vibration est active en Raman seulement si le mouvement vibrationnel s’accompagne d’un changement de la polarisabilité.
Cas des hémoprotéines :
Dans le cas des hémoprotéines, où les transitions électroniques sont bien caractérisées, la longueur d’onde d’excitation choisie correspond le plus souvent au maximum d’absorption UV- visible de la bande de Soret. De cette manière, les modes de vibrations exaltés sont les modes associés à la porphyrine et aux ligands directs du fer. Il est ainsi possible d’observer spécifiquement le comportement vibrationnel de l’hème, d’obtenir des informations structurales sur la nature
chimique du ligand, sa force de liaison au fer, sa conformation ou encore son interaction avec le site actif et son environnement.
4.2.2. La spectroscopie de Raman de résonance pour l’étude des complexes héminiques des NO-Synthases
Montage expérimental :
Deux sources de Laser ont été utilisées pendant ma thèse. La première ayant une longueur d’onde excitatrice de 413,1 nm provient d’un laser à Krypton ionisé (Spectra-Physics 2000). La seconde est un laser à Hélium-cadmium ionisé (Kimmon IK) ayant une longueur d’onde excitatrice de 441,6 nm. Le choix du laser est dépendant du mode de vibration que l’on veut exalter. On utilise une longueur d’onde excitatrice aux alentours de 441,6 nm pour les complexes FeIIINO, FeIINO et FeIICO (bande de Soret aux alentours de 440 nm, 436 nm et 445 nm respectivement) et de 413,1 nm pour exalter les modes de vibrations de l’hème à l’état FeII et FeIII (bande de Soret aux alentours de 412 nm et 394 nm respectivement). Afin d’éviter la photo-oxydation et la dégradation de l’échantillon pendant l’expérience, la puissance du faisceau laser incident est maintenue entre 5 et 10 mW grâce à un filtre placé entre le laser et l’échantillon (Figure 36, en gris).
Laser Monochromateur Filtre de puissance Filtre notch Détecteur CCD Pompe Hélium Echantillon
Figure 36 : Représentation du montage et du trajet optique du faisceau laser utilisé au laboratoire.
Pour des mesures à température ambiante, les échantillons sont préparés dans des tubes RPE tronqués. Le porte-échantillon est équipé d’un moteur qui permet la rotation de l’échantillon sur lui- même de manière à ne pas exposer toujours la même partie de l’échantillon à la lumière incidente et prévenir la dégradation de l’enzyme, sensible au rayonnement. Dans le cas des mesures à basse température, nous avons un système adapté pour monter un cryostat refroidi à l’hélium (Figure 36,
en pointillé). Le cryostat utilisé est un cryostat ESR900 (Oxford Instruments, Oxon, Angleterre) qui permet la mesure sur des échantillons contenus dans des tubes RPE (V = 100 µL) à 4 K.
Le détecteur, de type CCD (Charge Coupled Device) est refroidi par de l’azote liquide. Un filtre (Kaiser Optical Systems) spécifique à la longueur d’onde d’excitation est placé sur le trajet optique juste avant le détecteur afin d’absorber le plus possible la lumière Rayleigh (incidente) (Figure 36, en vert). Les fentes du détecteur sont ouvertes à 100 µm permettant une résolution spectrale ≤ 3 cm-1. Le détecteur est relié à un système informatique permettant le pilotage, l’enregistrement et l’accumulation des données par le logiciel Speclab V 3.03 (Jobin Yvon). Le monochromateur du spectromètre est calibré en utilisant la longueur d’onde de la lumière d’excitation comme référence.
Accumulation des spectres :
L’alignement du laser est réalisé dans un premier temps sur un échantillon d’éthanol dont le signal Raman est très intense et permet de trouver une géométrie convenable pour l’acquisition du signal. Ensuite la position du faisceau est ajustée sur l’échantillon protéique pour optimiser le rapport signal/bruit. Suivant la qualité de l’échantillon, la puissance du laser, le degré d’exaltation de l’effet Raman, la qualité du spectre peut varier. Chaque spectre enregistré est le résultat de l’accumulation de 40 à 200 spectres individuels obtenus avec des temps d’accumulation de 20 à 60 secondes pour chacun d’entre eux. Selon la qualité du rapport signal/bruit, on réalise ensuite la moyenne de 5 à 20 de ces spectres afin d’obtenir le spectre moyen final.
Traitement des données :
Le traitement des données réalisé avec le logiciel GRAMS/32 (Galactic Industries Corp., USA) permet de moyenner les séries de spectres, de soustraire la contribution du tampon de référence, de supprimer des contributions parasites (bruit électronique, pixel défaillant), de corriger la ligne de base afin d’éliminer la contribution de la fluorescence de l’échantillon et de déterminer précisément les fréquences de vibration de l'espèce présente dans l'échantillon. L’identification de la composante spectrale associée à chaque pic est réalisée directement en simulant le pic par une fonction gaussienne. Dans le cas des signaux plus larges et plus complexes, le signal est simulé avec une somme de plusieurs fonctions gaussiennes. Un exemple de spectre Raman de résonance correspondant à l’espèce FeIII HS-5C de iNOSoxy est représenté en Figure 37.
600 800 1000 1200 1400 1600 = 152 63 iNOSoxy +BH4 +Arg vinyl = 16 27 = 143 89 4pp = 14 29 = 134 74 = 7516 3 = 677 7 = 115 21 Nombre d'onde (cm-1)
Figure 37 : Exemple de spectre obtenu en Raman de résonance de iNOSoxy en présence du substrat arginine et cofacteur BH4 : FeIII HS-5C.
Les fréquences de résonance des modes vibrationnels de la porphyrine sont pointées en rouge sur la Figure 37. Les différentes bandes des spectres obtenus en spectroscopie Raman de résonance ont été attribuées par analogie avec les données déjà connues sur iNOS, eNOS, nNOS, saNOS et bsNOS pour les complexes FeIII, FeII, FeIICO, FeIIINO, FeIINO, FeIIO
2 de NOS (reportés en Annexe 4 [10, 102, 115, 160, 161, 163, 167, 186-197].
4.3. La spectroscopie infrarouge à transformée de Fourier et réflexion totale atténuée