CHAPITRE 2 Matériels et méthodes
1. Expression et purification des NO-Synthases
1.1. Expression et purification de la NO-Synthase inductible sauvage
iNOSoxy sauvage de souris, constituée uniquement de la partie oxygénase de la protéine (les acides aminés 65-498) a été produite par E. coli selon un protocole mis au point au sein du laboratoire de D. J. Stuehr [70, 123]. La souche E. coli BL21 utilisée contient un vecteur d’expression (pcWORI) contenant la séquence du domaine oxygénase d’iNOS. L’expression d’iNOSoxy est sous le contrôle du promoteur de la -galactosidase. La souche bactérienne surexprime iNOSoxy supplémentée d’une étiquette de 6 histidines en position C-terminale et contient un gène de résistance à l’ampicilline. Les solutions et verreries utilisées sont toutes stérilisées au préalable par autoclavage.
Culture et induction :
La bactérie transformée est inoculée dans 5 mL de culture Terrific Broth (Sigma) contenant 10 % de glycérol dans un tube stérile. 125 µg.mL-1 d’ampicilline sont ajoutés au milieu de culture pendant toute la phase de croissance et d'induction afin d’éliminer toute autre bactérie contaminante. Le tube stérile est maintenu à 37°C sous agitation (150 tr.min-1). Au bout de 6-7 heures, le milieu est ré-inoculé dans 400 mL de milieu TB. La culture est de nouveau maintenue à 37°C sous agitation (150 tr.min-1) pendant toute la nuit. Le lendemain les 400 mL de pré-culture sont répartis dans 8 erlenmeyers de 2,5 L avec chacun 450 mL de milieu TB et sont maintenus à 37°C sous agitation (150 tr.min-1). La densité optique (DO), mesurée régulièrement, doit atteindre la valeur de 1 à 600 nm, qui indique que l’on est dans une phase de croissance optimale pour induire l’expression de la protéine. 1 mM d’isopropyl--D-thiogalacto-pyranoside (IPTG) permet d'induire l'expression du gène de la NOS. L’expression de l’hème est, quant à lui, sous le contrôle de l’acide -amino- lévulinique (-ala, 400 µM). Cette étape d’induction dure 72 heures à 20°C.
Lyse cellulaire :
Une centrifugation permet de rassembler les bactéries. Elles sont re-suspendues dans un tampon de lyse (un tampon phosphate (KPi) 100 mM pH 7,4 contenant 10 % de glycérol, 250 mM de NaCl, 1 mM d’acide éthylène diamine tétra-acétique (EDTA), 5 µg.mL-1 d’aprotinine (antiprotéase), 1 µg.mL-1 de leupeptine (antiprotéase), 5 µg.mL-1 de pepstatine A (antiprotéase), 1 mg.mL-1 de lysozyme, 1 mM de fluorure de phenylméthanesulfonyle (PMSF) dans du
de la pression osmotique permet la rupture de la membrane des bactéries. La lyse est accentuée par un double passage des bactéries dans un disrupteur (Constants Systems Disruption Systems, Northants, UK) exerçant une pression de 1 bar.
Séparation et purification des protéines :
Après la lyse bactérienne, une centrifugation est nécessaire pour séparer l'extrait soluble, qui contient la fraction protéique, des résidus membranaires qui précipitent. Les protéines, contenues dans le surnageant, sont récupérées par précipitation au sulfate d’ammonium 0,291 g.mL-1 ajouté pendant ½ heure à 4°C. La solution est ensuite maintenue sous agitation pendant 30 min à 4°C. Après centrifugation, le culot contenant le précipité protéique est solubilisé dans un tampon de re- suspension MCAC (Metal Chelate Affinity Chromatography : un tampon TRIS 100 mM pH 7,4 contenant 10 % de glycérol, 250 mM de NaCl, 1 mM de PMSF dans de l’éthanol) avec 5 mM d’imidazole. Une dernière centrifugation permet d’éliminer les éventuels débris cellulaires résiduels avant l’étape de purification par chromatographie d’affinité sur colonne de résine chargée en nickel (His-Bind®, Novagen).
La colonne, stockée dans 50 % d’eau et 50 % d’éthanol, est rincée extensivement à l’eau. Elle est ensuite conditionnée dans le tampon MCAC contenant 5 mM d’imidazole afin d’occuper les sites de fixation non spécifiques. La colonne est maintenue à 8°C pendant toute la phase de purification (en chambre froide). La solution de protéine est chargée sur la colonne et deux cycles de lavage sont réalisés avec du tampon MCAC contenant 5 mM imidazole puis 60 mM imidazole. A ce stade, les protéines retenues sur la résine sont majoritairement iNOSoxy qui se fixe spécifiquement aux sites à nickel grâce à son étiquette histidine. L’élution est effectuée avec du tampon MCAC contenant 160 mM d’imidazole.
Une étape finale de dialyse de deux fois 24 heures est nécessaire afin d’éliminer l’imidazole et de conditionner la protéine dans un tampon KPi 100 mM pH 7,4 contenant 10 % de glycérol, 250 mM de Nacl, 1 mM de PMSF.
Enfin, la solution de iNOSoxy obtenue, est congelée dans de l’azote liquide et conservée à -80 °C.
Deux types de préparations de iNOSoxy ont été réalisés suivant ce protocole : en absence de substrat et de cofacteur BH4 ou alors en présence uniquement du cofacteur BH4. Pour cette condition, le BH4 est alors ajouté au milieu de culture, aux tampons de lyse, de re-suspension et de dialyse avec une concentration finale de 50 µM. Le dithiothréitol (DTT 3mM) est également ajouté afin de protéger le BH4 de son oxydation en BH2. Ce protocole de purification nous permet d’obtenir jusqu’à 200 mg de iNOSoxy par préparation.
1.2. Expression et purification de la NO-Synthase de Bacillus subtilis sauvage
bsNOS sauvage a été surexprimée dans E. coli selon le même protocole que iNOSoxy à l’exception de quelques adaptations [68, 70, 123]. E. coli BL21 est transformée avec le plasmide pET15B contenant la séquence codante pour bsNOS et contient un gène de résistance à l’ampicilline. bsNOS est supplémentée d’une étiquette de 6 histidines en position N-terminale (au lieu de C-terminale pour iNOSoxy). L’induction de l’expression se fait sur une nuit (versus 72 heures pour iNOSoxy). bsNOS a une plus faible affinité pour la colonne de nickel que dans le cas de iNOSoxy. C’est pour cette raison que les concentrations en imidazole sont diminuées pour éviter l’élution de la protéine pendant les phases de lavage (30 mM d’imidazole au lieu de 60 mM pour iNOSoxy). bsNOS est toujours exprimée en absence de substrat et de cofacteur BH4.
1.3. Expression et purification des mutants de la NO-Synthase de Bacillus subtilis
La mutation sur le tryptophane Trp 66 (W66) de bsNOS a été effectuée au laboratoire avant ma venue grâce à un kit de mutagénèse dirigée « Quick Change KL » permettant de remplacer le tryptophane 66 par un autre acide aminé : la phénylalanine (Phe), la tyrosine (Tyr), l’histidine (His), la leucine (Leu) ou l’alanine (Ala) :
- Protéine sauvage (WT) :
TCTGCCGATGCAGCGGTTGCTGTTTCTCAAAGCCATTTTCGCCCCGTG ; - Trp 66 Phe (F) : W66F
TCTGCCGATGCAGCGGTTGCTGTTTCTGAAAGCCATTTTCGCCCCGTG ; - Trp 66 Tyr (Y) : W66Y
TCTGCCGATGCAGCGGTTGCTGTTTCTATAAGCCATTTTCGCCCCGTG ; - Trp 66 His (H) : W66H
TCTGCCGATGCAGCGGTTGCTGTTTCTGTGAGCCATTTTCGCCCCGTG ; - Trp 66 Leu (L) : W66L
TCTGCCGATGCAGCGGTTGCTGTTTCTGAGAGCCATTTTCGCCCCGTG ; - Trp 66 Ala (A) : W66A
TCTGCCGATGCAGCGGTTGCTGTTTCTCGCAGCCATTTTCGCCCCGTG Ces mutations ont été vérifiées par séquençage d’ADN.
Le protocole d’expression et de purification des mutants W66F, W66Y, W66H, W66L et W66A a été développé à partir du protocole déjà établi pour bsNOS sauvage. Pour une meilleure stabilité de la protéine mutée, il faut fixer le pH du tampon de lyse, de resuspension, du MCAC et des tampons de dialyse à pH 9 pour les mutants W66F et W66Y et à pH 8 pour les mutants W66H,
W66L et W66A. En raison d’une plus faible affinité des mutants pour la colonne de nickel on procède à un seul lavage à 10 mM d’imidazole (au lieu de 30 mM pour bsNOS sauvage).