La spectroscopie RPE pour l’étude des complexes héminiques des NO-Synthases

RPE pour l'étude des hémoprotéines : configuration haut spin et bas spin

Les propriétés magnétiques et électroniques des complexes de fer dépendent de leur état d’oxydation ainsi que de la nature des ligands. Pour décrire les espèces FeII _(3d6_{) et Fe}III _(3d5_{), la} théorie du champ de ligand est la plus utilisée. Un champ à symétrie octaédrique lève la dégénérescence des orbitales d du fer en deux groupes séparés par une énergie ∆. Le plus énergétique, noté e_g, inclut deux orbitales d_x²-y² et d_z², qui interagissent fortement avec les orbitales des ligands pour former des liaisons de type . En raison de leurs orientations spatiales, les trois orbitales dxy, dyz et dxz de plus basse énergie, de symétrie t2g, participent principalement à des interactions de type  avec les orbitales des ligands. Si le champ de ligands est fort, ∆ est supérieure à l’énergie d’appariement des électrons et ceux-ci se répartissent dans les sous niveaux de plus faible énergie, donc dans les trois orbitales de symétrie t_2g. Le complexe est alors dit à spin faible (S=0 pour l’espèce FeII _{et S=1/2 pour l’espèce Fe}III_{) ou bas spin (BS) (Figure 42). Si le champ de ligands} est faible, ∆ est inférieure à l’énergie d’appariement des électrons et les électrons de valence se répartissent pour satisfaire la règle de multiplicité de spin de Hund. Le complexe aura alors un spin fort (S=2 pour l’espèce FeII _{ou S=5/2 pour l’espèce Fe}III_{) ou haut spin (HS). Les électrons} occuperont les orbitales eg et t2g (Figure 42).

Figure 42 : Configuration électronique des orbitales 3d du fer au degré d’oxydation III en fonction de l’intensité du champ de ligand pour un champ octaédrique.

La configuration bas spin, dans le cas des hémoprotéines, correspond à celle d’un ion ferrique 6C. Un seul doublet de Kramer ms =  1/2 est impliqué dans la transition observée [203]. Comme l’électron n’est pas dans une symétrie isotrope, l’interaction du spin électronique avec le

champ extérieur donne lieu à trois valeurs de g : gx, gy et gz. Par convention, dans le cas des hémoprotéines, les deux valeurs de g qui correspondent au plan de l’hème sont appelées g_x et g_y. La valeur qui correspond à la direction axiale de l’hème est appelée gz. Les espèces BS des NOS ont des valeurs de g proches de g_z=2,3 g_y=2,2 et g_x=1,90 (Annexe 4).

La configuration haut spin correspond à celle d’un hème FeIII _{5C. Les valeurs de ms} possibles sont  5/2,  3/2 et  1/2. Ces six états de spins sont regroupés en trois doublets de Kramer. La différence d’énergie en champ nul (Zero Field Splitting, ZFS) entre les doublets de Kramer de la configuration haut spin est très faible. L’effet Zeeman est alors négligeable devant le ZFS et celui-ci contrôle l’allure du spectre RPE. Le ZFS est caractérisé par deux paramètres énergétiques E et D qui correspondent, respectivement, aux paramètres rhombique et axial de l’environnement du fer en champ nul. Le spectre RPE du FeIII _{haut spin traduit majoritairement les transitions du} doublet de Kramer le plus bas en énergie (le doublet 5/2) (Figure 43). Pour un système axial, E/D = 0 et on observe deux résonances à des valeurs de g effectifs perpendiculaire geff┴~6 et parallèle geff║~2. Plus le système devient rhombique, plus la première composante se dédouble pour donner un spectre avec gxeff ≠ gyeff [203] et des valeurs de g proches de gxeff (ou g1eff) = 7,6, gyeff (ou g2eff) = 4 et gzeff (ou g3eff) = 1,8 dans le cas des NOS (Figure 43, [204-207], Annexe 4).

Figure 43 : Séparations des valeurs de geff des trois doublets de Kramer pour un complexe

octaédrique FeIII_{HS. Les valeurs de geff observées dans le cas des NOS sont indiquées par}

un trait gris.

Conditions expérimentales :

La spectroscopie RPE à 9,4 GHz (bande X) a été réalisée avec le spectromètre Bruker Elexsys E500 équipé d’une cavité standard TE pour analyser les espèces FeIII_{, Fe}II_{NO et le radical} BH4+•. La spectroscopie RPE à 285 GHz a été réalisée sur un spectromètre haut champ construit au laboratoire [208] pour déterminer les valeurs de g du radical BH +•_{. Le champ magnétique a été}

calibré avec un échantillon d’oxyde de magnésium (l’erreur absolue sur la valeur de g est de 10-4_. Cependant la précision relative de g dans nos conditions expérimentales est de 2 x 10-5_{). La} température est régulée par un cryostat refroidi par un flux d’hélium (Oxford Instruments) et permet de stabiliser celle-ci à une valeur fixe.

Les conditions d’analyses ont été adaptées à l’espèce que l’on cherche à détecter :

- les espèces haut spin : température fixée à 10 K ± 2 K avec une puissance micro-onde de 2 ou 4 mW et une amplitude de modulation de 1, 2 ou 2,5 mT.

- les espèces bas spin : température fixée à 10 K ± 2 K avec une puissance micro-onde de 0,25 mW et une amplitude de modulation de 1 mT.

- les espèces FeII_{NO : température fixée à 10 K ± 2 K avec une puissance micro-onde de} 0,001 ou 0,004 mW et une amplitude de modulation de 0,4 ou 0,5 mT.

- l'état radicalaire du cofacteur (BH₄ ou THF) en bande X : la température est d’abord fixée à 10 K avec une puissance micro-onde de 0,25 mW et une amplitude de modulation de 1 mT. Il est ensuite été analysé à 70 K avec une puissance micro-onde de 0,25, 0,06 ou 1 mW et une amplitude de modulation de 0,4 mT. La quantité de radical présent dans les échantillons a pu être déterminée avec une gamme de sulfate de cuivre de concentration connue (de 50 à 300 µM) enregistrée dans les mêmes conditions d'analyse que le radical.

- l'état radicalaire du cofacteur (BH4) à haut champ : la température est fixée à 4 K, la puissance micro-onde à 0,25 µW et l’amplitude de modulation à 2 mT.

Les simulations des spectres RPE ont été réalisées avec le logiciel Easyspin [209] sous Matlab (The MathWorks) et avec des programmes écrits au laboratoire.