Structure du monomère

La NOS est une protéine homo-dimérique. La Figure 9 représente une structure schématique des trois monomères de NOS de mammifère. Chacun des monomères contient 2 domaines : un domaine oxygénase (en rouge) et un domaine réductase (en rose).

Figure 9 : Représentation schématique de la structure du monomère de NOS de mammifère. Le domaine oxygénase est en rouge. Le domaine réductase est représenté en rose. La partie N-Terminale diffère selon l'isoforme [54].

Le domaine oxygénase :

C’est dans le domaine oxygénase (en rouge sur la Figure 9), situé du coté N-terminal qu'a lieu la réaction catalytique. La NOS réalise dans un premier temps l’oxydation de l'arginine en N- hydroxy-arginine (NOHA). Dans un second temps le NOHA est oxydé en L-citrulline (Cit) avec production concomitante d’une molécule de NO (Figure 10).

Figure 10 : Réaction en deux étapes catalysée dans le domaine oxygénase de la NOS. L’arginine est oxydée en NO et citrulline en passant par la formation d’une espèce intermédiaire : la N-hydroxy-arginine [55].

Le domaine oxygénase est constitué des éléments nécessaires à la synthèse de NO c’est à dire du site de fixation du substrat (Arg ou NOHA), du site de fixation du cofacteur tetrahydrobioptérine (BH4) (Figure 11), du site de fixation de l'hème. L’hème, situé au cœur du site actif, est une protoporphyrine de fer de type IX (Figure 11) et le fer a pour ligand proximal une cystéine (Cys 419 pour nNOS, Cys 184 pour eNOS ou Cys 200 pour iNOS humaines).

Figure 11 : Représentation chimique du cofacteur tetrahydrobioptérine et de l’hème.

La partie oxygénase est reliée au domaine C-terminal par un inter-domaine correspondant au site de reconnaissance de la calmoduline (CaM) qui est un senseur de calcium. Pour les deux NOS constitutives (eNOS et nNOS) la fixation de calcium sur CaM permet d'activer la protéine en favorisant le transfert d'électron du domaine réductase vers le domaine oxygénase [56, 57]. Dans le cas de iNOS, le calcium est toujours fixé sur la CaM et iNOS est exprimée directement sous forme active.

Le domaine réductase :

Le domaine C-terminal correspond au domaine réductase (en rose sur la Figure 9), il contient les sites de fixation de la flavine adénine dinucléotide (FAD), de la flavine mononucléotide (FMN) et du NADPH [56, 58, 59]. Ce domaine est responsable de l'acheminement des électrons nécessaires à la réduction du fer situé dans le domaine oxygénase. Les transferts d’électrons au sein du domaine

réductase sont soumis à des régulations extrêmement complexes et sont le sujet de plusieurs revues [60-62].

Différences entre les isoformes :

Il y a environ 60 % d'homologie de séquence entre les différentes NOS de mammifères. Les deux NOS constitutives (eNOS et nNOS) ont des séquences supplémentaires nécessaires à leurs localisations cellulaires (Figure 9). La nNOS contient un domaine PDZ en zone N-terminale. Ce domaine est un site de reconnaissance et va permettre à nNOS d'être accolée au récepteur NMDA qui, lui aussi, a un domaine PDZ (voir 1.1.). Les sites de myristoylation (Myr) et palmitoylation (Palm) de eNOS lui permettent d’être ancrée à la membrane plasmique.

Cas des NOS bactériennes :

Les homologies de séquences entre la NOS de mammifère et la NOS bactérienne se limitent au domaine oxygénase et sont d'environ 44 %. Aucune bactérie n'a montré la présence d'une séquence codant pour le domaine réductase directement rattaché au domaine oxygénase à l'exception de Sorangium cellulosum [63] et de certaines cyanobactéries [64, 65]. Comme la NOS de mammifère, le domaine oxygénase contient le site de fixation de l’hème et le site de fixation du substrat (Figure 12, partie en rouge). En revanche le site de fixation du cofacteur est modifié par rapport à la NOS de mammifère. La poche de fixation est beaucoup plus ouverte et la nature du cofacteur de la NOS bactérienne n’est pas encore déterminée à ce jour.

Figure 12 : Représentation schématique de la structure des NOS de procaryotes comparée à celle des eucaryotes [66].

Plusieurs protéines ont été proposées comme jouant le rôle de réductase pour la NOS bactérienne. La flavodoxine dans le cas de bsNOS s'est avérée être un bon donneur d'électron pour la synthèse de NO in vitro [67]. D'autres études ont montré que la NOS de Deinococcus radiodurans (drNOS) pouvait produire NO quand un domaine réductase de NOS de mammifère lui était apposé [68]. En revanche, des réductases multiflaviniques telles que la sulfite réductase se sont avérées

inefficaces pour remplir le rôle de réductase avec la NOS bactérienne [69]. Enfin, il est proposé que la NOS bactérienne puisse produire NO sans réductase spécifique. Elle pourrait utiliser les partenaires redox disponibles dans la bactérie et de manière non spécifique [52].

Sorangium cellulosum est une bactérie gram négative qui fait exception sur ce point. Sa NOS (scNOS) est composée d’un domaine oxygénase (en position C-terminale) rattaché de manière covalente à un domaine réductase (en position N-terminale) [63] (Figure 12). Le site de fixation de FMN est remplacé par un centre fer-soufre dans le cas de scNOS, capable de réaliser des transferts à 1 électron. Les sites de fixation de FAD et de NAD sont conservés permettant ainsi au NADPH de rester le dernier donneur d’électron (Figure 12) vers le domaine oxygénase.

Le site de fixation du zinc, présent en position N-terminale dans le cas des NOS de mammifère (Figure 9), n’est pas retrouvé dans le cas de la NOS bactérienne à l’exception de Streptomyces turgidiscabies (Figure 12). Ce site, important pour la dimérisation de la NOS de mammifère, ne semble pas indispensable à la dimérisation de la NOS bactérienne.

L’absence de réductase et la nature du cofacteur pour les NOS bactériennes sont encore des sujets très controversés et soulignent les différences structurelles qui existent entre les NOS de mammifères et les NOS bactériennes mais aussi entre les NOS bactériennes elles mêmes.