Chapitre 1 : Etude bibliographique
II. Structure des CBMs
Actuellement 81 familles de CBMs sont recensées (mis à jour le 15/09/2017,
(Lombard et al., 2014)). Les CBMs sont aussi regroupés selon leur type (A, B ou C) d‟après
des études structurales et biochimiques (Boraston et al., 2004).
a) Classement des CBMs
Les CBMs de type A sont capables de se lier préférentiellement à la cellulose très
cristalline et insoluble et/ ou à la chitine. Dans une étude de McLean et collaborateurs,
plusieurs CBMs de type A ont la même affinité sur de la cellulose amorphe (PASC ou
phosphoric acid-swollen cellulose) et de la cellulose cristalline (BMCC ou bacterial
microcrystalline cellulose) tel que le CBM2a de la xylanase 10A de Cellulomonas fimi (C.
fimi) (McLean et al., 2002). Il a également été démontré que le CBM3a provenant de la
protéine scaffold CipA du cellulosome de Clostridium thermocellum (C.thermocellum)
reconnaissait du xyloglucane (en solution ou dans une paroi cellulaire végétale) en plus de la
cellulose cristalline, l‟affinité pour le xyloglucane étant entre cinquante et cent fois plus faible
que l‟affinité pour la cellulose cristalline. Cependant, ce CBM ne se lie pas aux
oligosaccharides dérivés du xyloglucane. Ceci suggère que la protéine identifie une
conformation du xyloglucane qui est absente dans les oligosaccharides (Hernandez-Gomez et
al., 2015).
La résolution de la structure pour une trentaine de CBMs de type A révèle une surface plane
constituée de résidus aromatiques très fortement conservés (tryptophane, tyrosine) ayant des
interactions hydrophobes de stacking par complémentarité avec les surfaces planes et non
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polaires de cristaux de cellulose ou de chitine (Figure 20A) (Bray et al., 1996; Din et al.,
1994b; Nagy et al., 1998). En effet, les acides aminés aromatiques de ces CBMs forment des
interactions (notamment des interactions de van der Waals) avec les cycles de pyranose exposés.
Ceux-ci se situent au niveau de la surface 110 hydrophobe des microfibrilles cristallines de cellulose
(Mattinen et al., 1997; Reinikainen et al., 1995, 1992; Tormo et al., 1996). Ceci a notamment été
mis en évidence pour le CBM1 de la cellobiohydrolase Cel7A produite par T. reesei et le
CBM3a de CipA de C. thermocellum (Lehtio et al., 2003). Ces CBMs sont qualifiés de CBMs
plans (Figure 21) (Gilbert et al., 2013). Certaines équipes ont pu mettre en évidence
l‟importance des tryptophanes dans la reconnaissance du ligand en étudiant des CBMs mutés.
Ainsi, Poole et ses confrères ont montré que les tryptophanes 12, 34, et 38 du CBM de la
xylanase A de Pseudomonas fluorescens, de la sous-espèce cellulosa, jouent un rôle essentiel
dans la liaison avec la cellulose (Poole et al., 1993). Hernandez-Gomez et collaborateurs ont
muté en alanine les résidus impliqués dans la surface hydrophobe du CBM3a (comportant les
résidus Asp56, His57, Tyr67, Arg112 et Trp118). Ceci a anéanti la reconnaissance des deux
ligands (la cellulose cristalline et le xyloglucane), ce qui indique que le même site de liaison
reconnait les deux polysaccharides. De plus, les mutants de la protéine avec seulement un des
cinq résidus muté gardent tous la reconnaissance de la cellulose (Hernandez-Gomez et al.,
2015). Par ailleurs, il est possible que les chaînes latérales des xyloses dans le xyloglucane,
qui ont des interactions avec la surface des CBMs de type A, contribuent à la liaison avec le
ligand. En effet, la reconnaissance des chaînes latérales pourrait expliquer pourquoi les
β-glucanes à liaisons multiples ne se lient pas aux CBMs de type A (Hernandez-Gomez et al.,
2015).
A) B) C)
Figure 20 : Représentation des sites de liaison des trois types de CBMs.
A) Le CBM de type A : structure RMN du CBM1 de T. reesei (code PDB 1CBH). B) Le CBM de type B :
structure cristallographique du CBM4 de C. fimi en complexe avec du cellopentaose (code PDB 1GU3). C) Le
CBM de type C : structure cristallographique du CBM6 de Bacillus halodurans en complexe avec du
laminarihexaose (code PDB 1W9W). Les chaînes latérales des acides aminés des CBMs impliquées dans la
reconnaissance du substrat sont en bâtons. Les ligands sont en bâtons bleus. D‟après (Gilbert et al., 2013).
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Les CBMs de type B peuvent se lier à des substrats très variés comme des
oligosaccharides solubles ou insolubles dérivés des hémicelluloses ou à de la cellulose
amorphe (Tomme et al., 1996). Ces CBMs présentent en général une masse moléculaire plus
importante que ceux de type A. Ils se lient aux régions internes des glucanes et sont capables
d‟accommoder les unités de sucre des oligosaccharides dans une poche allongée dans laquelle
se trouvent plusieurs sous-sites (Figure 20B). En général, les CBMs accommodent une chaîne
individuelle de glucanes contenant au maximum trois sucres (Boraston et al., 2004). Ces
CBMs sont alors qualifiés d‟endo-CBMs (Figure 21) (Gilbert et al., 2013). La capacité de
liaison de ce type de CBM est déterminée par le DP du ligand glucidique. Par exemple,
l‟affinité sera importante pour des hexasaccharides alors que les interactions avec des
oligosaccharides de DP inférieur ou égal à 3 sont négligeables (Boraston et al., 2004). En
général, les constantes d‟association de ces CBMs pour leur ligand sont d‟environ 2.10
4M
-1(Boraston, 2005). La présence de ces endo-CBMs favorise l‟activité des GHs contre les
polysaccharides insolubles (Hall et al., 1995; Tomme et al., 1988) ou contre les substrats
branchés (Cuskin et al., 2012).
Figure 21 : Représentation schématique des trois types de CBMs.
D‟après (van Bueren, 2013).
Pour finir, les CBMs de type C reconnaissent des petits saccharides ou les sucres
terminaux des polysaccharides complexes et se lient donc à une seule unité de sucre (Figure
20C). Ces CBMs sont appelés exo-CBMs (Figure 21) (Gilbert et al., 2013). Ils permettent une
augmentation considérable de l‟activité des glucosidases agissant en exo même si le glucane
est soluble et facilement accessible à l‟attaque enzymatique (Cuskin et al., 2012). Ces CBMs
ont des propriétés semblables aux lectines pour une liaison optimale aux mono-, di- ou
tri-- 64 tri--
saccharides. Ainsi, le réseau de liaisons hydrogènes entre protéine et ligand est plus important
pour les CBMs de type C que pour ceux de type B (Boraston et al., 2004). Pour ces
exo-CBMs qui ciblent les produits de dégradation générés par les pectates lyases ou les xylanases,
il a été proposé qu‟ils orientent les enzymes vers les régions de la paroi cellulaire végétale qui
ont déjà subi une dégradation et qui sont donc accessibles pour une attaque enzymatique
(Montanier et al., 2009).
Même si l‟orientation et le positionnement des résidus aromatiques des sites de liaison
des CBMs sont les premiers éléments clés de la spécificité et de l‟affinité de ces protéines,
d‟autres interactions (dont les liaisons hydrogènes directes) ont un rôle significatif dans la
reconnaissance du ligand par le CBM. Les glucides sont des molécules bipolaires qui ont une
grande capacité à former des liaisons hydrogènes avec des résidus polaires des sites de liaison
des protéines (Boraston et al 2004). L‟importance des liaisons hydrogènes directes dans
l‟interaction CBM-sucres cibles varie selon le type de CBM. Pour les CBMs de type A, les
liaisons hydrogènes joueraient un rôle mineur dans la reconnaissance du ligand. Pour les
CBMs de types B et C, une perte d‟affinité avec le ligand pourrait être la conséquence de la
perte d‟une liaison hydrogène ou de changements structurels dans les sites de liaison au ligand
(Kormos et al., 2000; Xie et al., 2001b).
b) Repliement des CBMs
Les CBMs varient largement dans leurs spécificités de ligand mais des repliements
communs ont été observés dans les protéines avec différentes spécificités et appartenant à
différents groupes taxonomiques (Tableau 7) (Czjzek et al., 2001; Sunna et al., 2001). Les
CBMs ont été classés selon leur repliement dans sept familles (Boraston et al., 2004) avec
comme repliement le plus fréquent, le sandwich β. Ce repliement correspond à deux feuillets
β dont chacun a entre trois et six brins β antiparallèles (Boraston et al., 2004). Le site de
liaison au ligand est localisé au niveau de la surface concave due à un des feuillets β. Ce site a
une topographie qui facilite le ciblage des régions internes des chaînes de glycanes (Boraston
et al., 2002b; Najmudin et al., 2006; Simpson et al., 1999). Le site de liaison au ligand peut
sinon se trouver dans les boucles qui connectent les deux feuillets (Czjzek et al., 2001). Ce
site de liaison peut cibler la fin (Montanier et al., 2011) où les régions internes des chaînes de
glycane (Czjzek et al., 2001).
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D‟autre part, les CBMs peuvent contenir un trèfle β, formé de trois unités de trèfle. Chacune
des unités contient quatre feuillets β. Ainsi douze feuillets β forment six épingles à cheveux.
Trois épingles à cheveux constituent un tonneau à six brins et les trois autres épingles
composent un bouchon triangulaire (Murzin et al., 1992). Il existe également un repliement
nommé repliement Hevein. Il correspond à une majorité de bobine et de deux petits feuillets β
et d‟une petite région d‟hélice (Boraston et al., 2004). La famille de repliement 7 incorpore
certains aspects du repliement Hevein en fusionnant ce type de repliement avec un petit
feuillet β ce qui explique la création d‟une famille de repliement différente (Boraston et al.,
2004). Pour finir, le repliement OB est constitué de cinq brins β formant un feuillet β fermé
par une hélice α (Murzin, 1993).
Par exemple, les CBM3a et CBM2b1 qui ont une conformation en β-jelly roll (sous
famille du repliement en sandwich β), sont fréquemment utilisés pour leur grande spécificité
de reconnaissance (respectivement la cellulose et les xylanes). C‟est pourquoi ils ont été
choisis pour cette thèse.
Tableau 7 : Classement des CBMs.
Mis à jour le 20/09/17, d‟après (Boraston et al., 2004; Guillén et al., 2010; Lombard et al., 2014).
famille de repliement repliement famille de CBM
1 sandwich β
2, 3, 4, 6, 9, 11, 15, 16, 17, 20, 21,
22, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32,
34, 35, 36, 41, 44, 47, 48, 51, 70
2 trèfle β 13, 42
3 nœud de cystéine 1
4 repliement unique 5, 12
5 repliement OB
(oligonucleotide/oligosaccharide binding) 10
6 repliement Hevein 18
7 repliement unique, contient un repliement
ressemblant au Hevein 14
Dans le document
Création d'enzymes multimodulaires à façon dédiées à la dégradation de substrats complexes
(Page 64-68)