Construction des protéines chimériques

Durant ce travail de thèse, plusieurs protéines recombinantes ont été produites (Figure

37). Ces protéines ont été exprimées soit sous leur forme native, soit en fusion avec Jo ou In.

Les plasmides codant pour le CBM3a de C. thermocellum et pour le CBM2b1-CBM2b2 de C.

fimi ont été gracieusement donnés par Harry Gilbert (Newcastle University, Angleterre). Les

protéines fluorescentes DsRed et sfGFP proviennent respectivement de chez Clontech et de

l‟équipe de Thierry Vernet. La protéine sfGFP (pour super folder) est un variant de la protéine

GFP qui peut se replier correctement après avoir été sécrété (Dammeyer and Tinnefeld, 2012).

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nom du plasmide représentation des gènes d‟intérêt provenance du plasmide

Thierry Vernet

Thierry Vernet

Thierry Vernet

Harry Gilbert

Harry Gilbert

Cédric Montanier

Cédric Montanier

Cédric Montanier

Marion de la Mare (notre équipe)

Julien Lefèvre (notre équipe)

Préparé durant la thèse

Préparé durant la thèse

Préparé durant la thèse

Préparé durant la thèse

Préparé durant la thèse

Figure 37 : Bilan partiel des différentes constructions utilisées dans cette thèse.

En orange : gène codant pour NpXyn11A ; en vert : gène codant pour un CBM ; en violet : gène codant pour une

protéine fluorescente ; en rouge : tag ou étiquette histidine ; en bleu : gène codant pour In ou Jo ; en rose :

linker ; en noir : le plasmide. Les barrettes verticales symbolisent les extrémités N- et C-terminales des

différentes constructions.

a) Construction des plasmides

Deux méthodologies ont été suivies pour la construction des nouveaux plasmides,

pETDuet_JoCBM3a, pETDuet_InCBM3a, pETDuet_CBM2b1 et pETDuet_JoCBM2b1. La

première méthode concerne la construction des plasmides codant pour les protéines CBM2b1,

JoCBM3a ou JoCBM2b1. Le plasmide pUC57 contenant le gène synthétique (GenScript) a

été doublement digéré par BamHI et SalI afin d‟obtenir nos inserts, de même que pETDuet_Jo

pour obtenir le vecteur linéarisé. Les tailles des différents fragments d‟ADN ont été vérifiées

sur gel d‟agarose puis les fragments d‟ADN ont été purifiés. Après ligature des inserts dans le

vecteur, les produits de ligature ont servi à transformer des cellules OneShot Top10. Des

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préparations plasmidiques ont été réalisées à partir de colonies isolées, leur pureté a été

vérifiée sur gel d‟agarose et les constructions confirmées par séquençage (Chapitre 2. 1).

La deuxième méthode concerne les plasmides codant pour les protéines InCBM3a et

InCBM2b1, suivant une approche de clonage par recombinaison homologue. Ici, les

plasmides pETDuet_JoCBM3a ou pETDuet_JoCBM2b1 ont servi de vecteur pour introduire

à la place du gène codant pour Jo, l‟insert codant pour In et provenant du plasmide

pACYCDuet_In (Figure 38). Tous les fragments d‟ADN ont été amplifiés par PCR et leur

taille a été vérifiée sur gel d‟agarose. Malgré un grand nombre de conditions expérimentales,

il n‟a pas été possible d‟amplifier la partie du vecteur codant pour CBM2b1 (Figure 39). Le

gène InCBM2b1 a alors été directement synthétisé dans le vecteur d‟expression pET28

(GenScript). Après recombinaison homologue, une extraction plasmidique de

pETDuet_InCBM3a a été évaluée sur gel d‟agarose et la construction confirmée par

séquençage (Chapitre 2. 1).

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Figure 39 : Gel d‟agarose après amplification par PCR.

1 : le produit d‟amplification de l‟insert codant pour In ; 2 : le produit d‟amplification du vecteur codant pour

CBM3a ; 3 : le produit d‟amplification du vecteur codant pour CBM2b1. Les flèches indiquent les tailles de

chaque fragment d‟ADN (429 bp, 5 927 bp et 5 729 bp respectivement).

b) Optimisation des conditions d’expression des protéines

Les conditions d‟expression des protéines ont été établies avant cette thèse, à

l‟exception des protéines CBM2b1, InCBM2b1, JoCBM2b1, InCBM3a et JoNpXyn11A. Pour

ces protéines, plusieurs conditions d‟expression ont été mises en œuvre afin d‟obtenir une

quantité de protéine suffisante pour leur étude. L‟expression des protéines a été réalisée

comme décrit dans le chapitre matériels et méthodes (Chapitre 2. 2) à l‟exception du volume

de culture qui était de 50 mL (Tableau 36). Le protocole suivi pour la purification par IMAC

sur une résine cobalt est celui détaillé dans le chapitre matériels et méthodes (Chapitre 2. 3), à

l‟exception de l‟élution de la protéine qui est réalisée en une seule étape avec 500 mM

d‟imidazole. La présence et le niveau d‟expression des protéines d‟intérêt sont évalués par gel

d‟électrophorèse SDS-PAGE.

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Tableau 36 : Conditions d‟expression des protéines.

a

: croissance des cellules réalisée à 37 °C pendant 4 heures ;

^b

: croissance des cellules réalisée à 37 °C jusqu‟à

une densité optique entre 0,4 et 0,6 à 600 nm ; X : condition non réalisée.

milieu et condition de culture

souche d‟E. coli ^{ZYP5052 LB}

b

23 °C, 25 h 16 °C, 20 h

^a

37 °C, 4 h 16 °C, 4 h 16 °C, 25 h

C41 (DE3) X X A B C

Tuner (DE3) X X D E F

JM109 (DE3) X X G H I

BL21 (DE3) M N J K L

A titre d‟exemple, l‟expression de la protéine InCBM3a réalisée dans la souche d‟E.

coli BL21 (DE3), en utilisant le milieu de culture autoinductible ZYP5052 à 23 °C pendant 25

heures (condition M, Figure 40) ce qui correspond à la condition permettant d‟obtenir une

grande quantité de protéines solubles et facile à mettre en œuvre.

A) B)

C) D)

Figure 40 : Gel d‟électrophorèse SDS-PAGE des différentes fractions de purification d‟InCBM3a

obtenues dans les conditions de culture résumées dans le Tableau 36.

C : culot après sonication et centrifugation ; SN : surnageant après sonication et centrifugation ; E : fraction éluée

avec 500 mM d‟imidazole pour les différentes conditions de culture mises en œuvre : A) conditions A, B, C et

N ; B) conditions J, K, L, M ; C) conditions D, E, F ; D) conditions G, H, I. Les flèches indiquent la bande

correspondante à InCBM3a dont la masse molaire est de 35 kDa.

- 159 -

Les protéines ont été exprimées et la quantité de protéines obtenue durant ma thèse,

entre 0,40 et 10,34 g.L

^-1

, a été suffisante pour leur étude (Tableau 37). La quantité de la

protéine InNpXyn11A sans le tag histidine n‟a pas pu être déterminée car elle n‟a pas été

purifiée.

Par ailleurs, un tryptophane a été introduit à l‟extrémité N-terminale de Jo ou d‟In afin de

pouvoir détecter ces protéines sur gel d‟électrophorèse SDS-PAGE par le système Stain Free

(Chapitre 2. 3. IV). Les propriétés biochimiques de Jo et d‟In n‟ont pas été altérées par cet

ajout et par convention les termes Jo et In seront employés pour les protéines contenant un

tryptophane.

Tableau 37 : Conditions optimisées pour l‟expression des protéines.

a

: quantité moyenne de protéine, pour à 1 L de culture ;

^b

: une seule production réalisée ; ND : non déterminé,

protéine non purifiée en l‟absence du tag histidine.

protéine souche d‟E. coli milieu et conditions de culture ^{quantité de protéine après}

purification (mg)

^a

CBM3a BL21 (DE3) milieu LB, induction à 37 °C, 4 h 57,26

JoCBM3a BL21 (DE3) milieu LB, induction à 37 °C, 4 h 26,51

CBM2b1 Tuner (DE3) milieu LB, induction à 16 °C, 20 h 31,85

JoCBM2b1 BL21 (DE3) milieu ZYP5052 23 °C 25 h 21,38

InCBM3a BL21 (DE3) milieu ZYP5052 23 °C 25 h 51,83

InCBM2b1 BL21 (DE3) milieu LB, induction à 16 °C, 20 h 71,23

^b

NpXyn11A BL21 (DE3) milieu LB, induction à 37 °C, 4 h 77,76

InNpXyn11A BL21 (DE3) milieu ZYP5052 37 °C 4 h puis 16 °C, 20 h 37,28

InNpXyn11A sans

tag histidine ^{BL21 (DE3) milieu ZYP5052 37 °C 4 h puis 16 °C, 20 h ND}

JoNpXyn11A Tuner (DE3) milieu LB, 37 °C, 4 h 44,76

^b

Jo BL21 (DE3) milieu LB, induction à 37 °C, 4 h 12,61

In BL21 (DE3) milieu LB, induction à 37 °C, 4 h 1,99

^b

InsfGFP BL21 (DE3) milieu LB, induction à 16 °C, 20 h 8,65

InDsred BL21 (DE3) milieu LB, induction à 16 °C, 20 h 1,90

^b

JoDsRed BL21 (DE3) milieu LB, induction à 16 °C, 20 h 15,50

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