Immunocytochimie et suivi d‟hydrolyse d‟un substrat complexe

Différentes études utilisant l‟immunocytochimie ont été réalisées, notamment dans le

groupe de Knox. Le tabac est un substrat largement étudié (Hervé et al., 2009; Marcus et al.,

2008; McCartney et al., 2005) ainsi que le pois (Blake et al., 2008; McCartney et al., 2000).

On retrouve des études sur Arabidopsis thaliana (Blake et al., 2008; Handford et al., 2003;

Orfila et al., 2005), une plante utilisée comme modèle ou sur la tomate (Ordaz-Ortiz et al.,

2009; Orfila and Knox, 2000) et le maïs (McCartney et al., 2004).

Par exemple, l‟activité catalytique de plusieurs enzymes ayant le même substrat peut être

comparée dans deux conditions : avec un substrat soluble et avec un substrat complexe.

L‟équipe de Gilbert a étudié la dégradation des cellules de tabac par deux mannanases, une

GH5 et une GH26. Les résultats sont surprenants car dans le cas des mannanes solubles la

GH26 est l‟enzyme la plus active. Au contraire, la GH5 est la plus active sur les mannanes

intégrés à une paroi cellulaire (Zhang et al., 2014). Ceci avait déjà été observé pour les

xylanases des familles GH10 et GH11. Les enzymes classées dans la famille GH11 dégradent

davantage les xylanes solubles alors que celles de la famille GH10 sont plus actives sur des

xylanes incorporés dans une paroi (Hervé et al., 2010, 2009; Pell et al., 2004; Vardakou et al.,

2008). Ceci corrèle avec la topologie des sites de liaison au substrat des GH10 et GH11. Dans

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les enzymes de la famille GH11, la fente de liaison est étroite et profonde et peut ainsi adapter

des chaînes de xylanes simples. Dans les enzymes de la famille GH10, les xylanes en

interaction avec d‟autres polymères de la paroi cellulaire accèdent au site plus large. Par

conséquent, il est probable que les GH10 n‟aient pas besoin d‟un CBM pour hydrolyser les

xylanes qui sont en association avec d‟autres composés de la paroi cellulaire alors que les

GH11 bénéficieront de la fonction de ciblage de ces modules pour déconstruire certaines

structures (Hervé et al., 2010, 2009).

Notre substrat d‟étude, la paille de blé a été déjà étudiée dans d‟autres contextes

(Burlat et al., 1997). Le substrat le plus proche déjà étudié par immunocytochimie est le grain

de blé (McCartney et al., 2005; Philippe et al., 2006). Une partie de ces projets a pour but de

mieux connaître les sondes (anticorps monoclonal ou CBM) (Blake et al., 2008; McCartney et

al., 2004) ou de les comparer entre-elles (McCartney et al., 2006). En dégradant le substrat

complexe par une mannanase (Ordaz-Ortiz et al., 2009), une pectate lyase (Blake et al., 2008)

ou une estérase (Marcus et al., 2010) certains épitopes apparaissent alors qu‟ils étaient

masqués par la matrice très dense de la paroi cellulaire ou au contraire, les épitopes peuvent

disparaitre lorsqu‟ils sont dégradés par l‟enzyme.

Une autre partie des travaux d‟immunocytochimie porte sur l‟étude de la dégradation

du subtrat par des enzymes multimodulaires directement sur des coupes afin de choisir le

CBM favorisant l‟hydrolyse. Pour cela, une enzyme est associée à différents CBMs (Hervé et

al., 2010). Il a été montré que la meilleure association entre un CBM et une enzyme est

dépendante des propriétés de ces deux modules. Par exemple, la pectate lyase Pel10A

produite par Cellvibrio japonicus est plus efficace avec le CBM2a (ciblant la cellulose

cristalline) sur le tabac parmi un panel de CBMs testés (ciblant la cellulose cristalline ou les

xylanes). A l‟inverse, il est plus intéressant d‟associer le CBM2b1-2 reconnaissant les xylanes

avec l‟arabinofuranosidase (Araf51A produite par Cellvibrio japonicus) (Hervé et al., 2010).

Un travail similaire a été réalisé par l‟équipe de Gilbert (Zhang et al., 2014) qui a montré qu‟il

est nécessaire de prendre en compte le substrat complexe dans le choix du CBM à associer à

une enzyme. En effet, la mannanase CjMan5A produite par Cellvibrio japonicus liée à un

CBM ciblant la cellulose cristalline (le CBM3a utilisé dans ces travaux) dégradera davantage

le tabac alors qu‟il est avantageux d‟ajouter un CBM spécifique des mannanes (le CBM27 de

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la mannanase Man5A de Thermotoga maritima) avec la même mannanase pour digérer des

coupes de Physcomitrella.

Ainsi, il a été mis en évidence que les liaisons entre un CBM et sa cible sont

différentes entre un polysaccharide partiellement purifié et un polysaccharide inclu dans les

parois intactes de cellules. Ceci a également été observé pour des modules catalytiques et leur

substrat. Cela est lié à l‟environnement des polysaccharides dans les parois primaire et

secondaire qui influence leur disponibilité pour la reconnaissance par des protéines. Les cibles

peuvent aussi être masquées par d‟autres polysaccharides et donc ne pas être reconnues par la

sonde ou l‟enzyme. Ceci met en évidence l‟importance de travailler sur un substrat complexe,

d‟utiliser plusieurs sondes et de digérer le substrat avec des enzymes.

Par ailleurs, l‟interprétation de résultats immunocytochimiques est complexe. Une sonde peut

indiquer la présence d‟une classe de polymères mais ceux-ci sont très complexes et peuvent

avoir des motifs de branchement nombreux et variés. L‟absence de liaison de la sonde

pourrait indiquer un polymère altéré structurellement ou un épitope masqué par d‟autres

polymères de la paroi comme alternatives à l‟absence d‟une classe de polymères (Marcus et

al., 2008).

Comme décrit ci-dessus, les microorganismes déconstruisent la paroi végétale à l‟aide

de nombreuses enzymes et selon plusieurs stratégies (enzymes libres ou associées dans un

cellulosome). Cette déconstruction peut également être favorisée si les enzymes sont

multimodulaires, avec la présence ou non d‟un CBM. Malgré l‟étude des différentes stratégies

présentes dans la Nature, de nombreuses questions restent en suspens. Comment sont choisies

les enzymes présentes dans un cellulosome ? L‟ordre des enzymes au sein du cellulosome

est-il important ? Cet ordre est-est-il aléatoire ou dirigé par la bactérie ? La distance entre enzymes

influence-t-elle la dégradation ? En quoi la composition ou la structure de la paroi impacte

l‟organisation du cellulosome ? Les enzymes cellulosomales sont-elles aussi flexibles que

lorsqu‟elles sont libres ? Et dans le cas d‟enzymes sécrétées, est-ce qu‟elles pourraient se lier

entre-elles pour se concentrer au niveau du substrat afin de le dégrader ? Le comportement

des enzymes en présence d‟un substrat simple est-il le même qu‟en présence d‟un substrat

complexe ? Cette thèse ne vise pas à répondre à toutes ces questions mais l‟objectif est de

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comprendre comment les microorganismes dégradent la biomasse lignocellulosique dans la

Nature.

Ce travail se base sur une alternative à l‟étude de protéines multimodulaires, via le

système Bio Molecular Welding, en associant à façon différents domaines. La première

hypothèse est que l‟ajout de Jo ou In à une extrémité d‟un domaine catalytique ou un CBM

n‟altèrera pas les propriétés biochimiques du domaine. La deuxième hypothèse est que la

complexité du substrat, lorsque celui-ci ne contient pas seulement la cible de l‟enzyme (soit

un polymère de xylose dans le cas de l‟étude d‟une xylanase), influence l‟activité

enzymatique. La troisième hypothèse est l‟importance du contexte dans lequel se trouve la

cible de l‟enzyme c‟est-à-dire si le substrat est utilisé sous forme broyé ou coupé ou entier. Ce

contexte pourrait entrainer une modification de l‟activité enzymatique.

Ainsi, grâce aux protéines Jo et In il sera possible d‟associer à façon différents domaines

(catalytiques et non catalytiques) en mimant le rôle des protéines cohésine et dockérine dans

un cellulosome. Avant de poursuivre nos études, il est important de vérifier les propriétés

biochimiques de chaque construction afin de valider cette approche (Chapitre 3). L‟activité

d‟une enzyme multimodulaire composée d‟un module catalytique xylanase et d‟un CBM, a

été comparée sur différents substrats par rapport à l‟activité du module catalytique seul

(Chapitre 4). En effet, existe-t-il une corrélation entre des activités enzymatiques réalisées in

vitro sur des substrats plus ou moins purifiés ? Le comportement d‟une enzyme

multimodulaire sur des substrats purifiés est-il le même ? Pour cela, différents substrats sont

disponibles, du substrat purifié au substrat complexe afin d‟augmenter au fur et à mesure la

complexité. Deux substrats complexes ont été choisis, le son et la paille de blé.

L‟originalité de ce travail de thèse repose également sur une analyse de l‟activité enzymatique

réalisée in muro sur des coupes de paille de blé par immunocytochimie. L‟objectif est de

savoir s‟il existe une corrélation entre des activités enzymatiques réalisées in vitro sur des

substrats plus ou moins purifiés et une activité réalisée in muro sur des coupes (Chapitre 5).

Plusieurs pistes de travail seront également entreprises dans cette thèse. Par exemble, j‟ai

initié un travail sur les six acétyle xylane estérases précédemment décrites afin d‟étudier leur

impact sur l‟activité de la xylanase sur des substrats complexes (Chapitre 6).

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Dans le document Création d'enzymes multimodulaires à façon dédiées à la dégradation de substrats complexes (Page 101-106)