CBMs

a) Le CBM2b1 de la xylanase 11A de Cellulomonas fimi

De manière générale, les CBMs de la famille 2 sont composés d‟environ 100 acides

aminés. La quarantaine de membres de cette famille est divisée en deux sous-familles (2a et

2b) (Tomme et al., 1998). Les CBM2a se lient à la cellulose cristalline (Gilkes et al., 1992) et

font partie des CBMs de type A alors que les CBM2b se lient aux xylanes (Figure 24) (Black

et al., 1995; Dupont et al., 1998; Tomme et al., 1998) et font partie des CBMs de type B. Les

CBM2a ont deux domaines de liaison à la chitine et une boucle de huit résidus avec un

tryptophane conservé (Simpson et al., 2000; Tomme et al., 1998). Cette boucle est peut-être la

cause de la différence des affinités entre CBM2a et 2b (Dupont et al., 1998). Une autre

explication des différences de spécificité de ligand entre CBMs de la famille 2 serait

l‟orientation des deux ou trois résidus de tryptophane qui sont exposés. En effet, pour les

modules de la famille 2a, ils sont plans ce qui leur permet d‟interagir avec les chaînes planes

- 72 -

retrouvées dans la cellulose. A l‟inverse, les CBM2 de la sous-famille b ont les résidus

perpendiculaires qui vont alors interagir avec l‟hélice des chaînes de xylanes (Simpson et al.,

2000). Cette orientation des tryptophanes serait liée à un résidu clé, en position 262 dans le

CBM2b1 de la xylanase 11A de C. fimi. Ce résidu est une glycine ou une alanine dans les

CBM2a et une arginine dans les CBM2b. Le résidu arginine étant plus gros que celui de

glycine, il empêcherait les cycles du tryptophane le plus proche de se positionner sous forme

plane et les forcerait à faire une rotation de 90° (Simpson et al., 2000)

.

Figure 24 : Représentation de structures cristallographiques de CBMs.

A) Le mutant R262G du CBM2b1 de la xylanase 11A produite par C. fimi (code PDB 1E5B). B) Le CBM3a de

la protéine scaffold CipA produite par C. thermocellum (code PDB 4B9F).

La xylanase 11A produite par C. fimi CfXyn11A a été mise en lumière lors d‟une

étude sur les xylanases produites par cette bactérie (Clarke et al., 1991). Elle provient d‟une

enzyme multimodulaire composée du module catalytique (xylanase), d‟un CBM interne classé

CBM2b1, d‟une carbohydrate estérase CE4 et d‟un deuxième CBM, localisé en position

C-terminale et nommé CBM2b2 (Millward-Sadler et al., 1994). L‟enzyme multimodulaire a une

affinité pour la cellulose (Millward-Sadler et al., 1994) et le xylane de glumes d‟avoine

(Black et al., 1995) alors que le domaine catalytique n‟a pas d‟affinité pour ces deux types de

polymères. Le domaine CBM2b1 a une affinité pour les xylanes (Black et al., 1995) mais pas

pour la cellulose (Millward-Sadler et al., 1994) alors que le domaine CBM2b2 a une affinité

pour les xylanes et pour la cellulose (Black et al., 1995). La structure cristallographique du

CBM2b1 représente la première structure d‟un CBM spécifique des xylanes (code

PDB 1XBD).

- 73 -

L‟étude de Bolam a permis de déterminer l‟importance du CBM2b2, de résoudre sa structure

tridimensionnelle par RMN (résonance magnétique nucléaire) et de comparer ses propriétés

biochimiques avec celles du CBM2b1 (Bolam et al., 2001). Ainsi, il a été démontré que ces

deux modules sont très proches à la fois au niveau de leur structure mais aussi de leurs

caractéristiques biochimiques. Ils ont une affinité pour les xylanes tels que les arabinoxylanes

de blé ou les xylanes de glumes d‟avoine qui sont des xylanes moins substitués. Ils agissent en

synergie pour se lier à la cellulose et aux xylanes (solubles et insolubles). Ceci signifie que

leur activité combinée est plus grande que la somme des activités individuelles. Dans

l‟objectif de travailler sur un substrat complexe il est donc judicieux d‟utiliser un seul de ces

CBMs qui ciblera uniquement les xylanes, préférentiellement les xylanes insolubles.

Les deux résidus de tryptophane exposés à la surface (Trp259 et Trp291) contrôlent la liaison

aux xylanes (Simpson et al., 2000). Ces résidus sont conservés dans les CBMs de la famille 2

où ils sont impliqués dans la liaison avec la cellulose et les oligosaccharides courts (Nagy et

al., 1998; Simpson et al., 1999; Xu et al., 1995). Leur orientation est essentielle pour la

détermination de la spécificité de liaison avec un ligand et les mécanismes de reconnaissance

et de liaison avec la cible sont identiques pour les deux CBMs (Bolam et al., 2001). Les

CBMs de CfXyn11A ont probablement évolué pour permettre à l‟enzyme de mieux se fixer

aux xylanes dans les cellules de paroi végétale, la liaison à la cellulose serait juste un effet

secondaire (Bolam et al., 2001).

La spécificité du CBM2b1 a dans un premier temps été étudiée de manière qualitative

en utilisant des gels d‟affinité. Ce CBM a été fusionné avec une glutathione-S-transférase

(GST) pour son étude. Il montre de l‟affinité pour les β-glucanes d‟orge, les xylanes issus de

blé, de seigle ou de glumes d‟avoine. Il ne reconnait pas la cellulose, sous forme soluble ou

insoluble, ni les pectines (Simpson et al., 1999). D‟autres publications ont mis en évidence

l‟association du CBM2b1 avec d‟autres polymères (Tableau 11). Ce CBM sera étudié dans

cette thèse.

- 74 -

Tableau 11 : Données de la littérature sur l‟affinité entre le CBM2b1 et des xylooligosaccharides.

XGA : xylane de glumes d‟avoine ; SSD : solid state depletion ; M : microcalorimétrie. D‟après (Bolam et al.,

2001; Simpson et al., 1999; Xie et al., 2001a).

Simpson et al 1999 Bolam et al 2001 Xie et al 2001

K

a

(M

^-1

) méthode K

a

(M

^-1

) méthode K

a

(M

^-1

) méthode

XGA insoluble X X 4,7.10

⁴

SSD X X

XGA soluble 2,43.10

³

M 5,9.10

³

M 6,42.10

³

M

β-glucane d‟orge 1,17.10

²

M X X X X

xylotriose 4,50.10

¹

M X X X X

xylotetraose 8,40.10

²

M X X X X

xylopentaose 2,43.10

³

M X X X X

xylohexaose ^3,45.10

3

RMN

3,4.10

³

RMN X X

5,26.10

³

M

Ce CBM a une forte affinité pour le xylane de glumes d‟avoine insoluble avec une

constante d‟affinité de 4,7.10

⁴

M

^-1

(Bolam et al., 2001). L‟affinité pour les autres polymères

testés (xylane soluble de glumes d‟avoine, xylopentaose ou xylohexaose) est légèrement

inférieure, de l‟ordre de 10

3

M

^-1

(Bolam et al., 2001; Simpson et al., 1999; Xie et al., 2001a).

La liaison légèrement plus faible pour les données de Simpson avec du xylane de glumes

d‟avoine comparée au xylohexaose peut être expliquée par la nature hétérogène de ces

xylanes (Simpson et al., 1999).

Le CBM2b1 a des affinités plus faibles pour des xylooligosaccharides plus petits comme du

xylotetraose ou du xylotriose ainsi que pour du glucane d‟orge (Simpson et al., 1999). Ainsi,

la protéine se lie de plus en plus fortement à des oligomères de xylose jusqu‟au xylohexaose.

Simpson et ses collègues ont suggéré que le site de liaison accommode au maximum six

unités de xylose. L‟étude de la liaison entre le xylohexaose et le CBM2b1 par RMN a permis

de confirmer que les résidus affectés par la liaison avec ce ligand sont sur la même face du

CBM. Ils sont proches des deux résidus de tryptophane exposés au solvant, le Trp259 et le

Trp291 qui font partie du site de liaison aux xylanes.

b) Le CBM3a de Clostridium thermocellum

Les CBMs de la famille 3 ont une séquence primaire comprenant entre 130 à 170

acides aminés. On retrouve deux sous-familles (3a et 3b) dont certains membres peuvent

reconnaitre la chitine (Tomme et al., 1998). Les CBM3 sont généralement classés comme des

modules de type A et ont une très forte affinité pour la cellulose cristalline (Gilad et al.,

2003).

- 75 -

La première structure de CBM3 à avoir été élucidée est celle provenant de la protéine

charpente CipA (cellulosome-integrating protein A) du cellulosome de C. thermocellum

(Tormo et al., 1996) (Figure 24B). Ce cellulosome est un complexe multienzymatique décrit

pour la première fois par l‟équipe d‟Edward Bayer (Bayer et al., 1983; Lamed et al., 1983a;

Pohlschroder et al., 1994) (Chapitre 1. 11. II). Ce CBM3 permet de favoriser l‟interaction

entre le complexe enzymatique et la cellulose en cours de dégradation. La structure

crystallographique de CtCBM3a présente une forme caractéristique de sandwich à neuf

feuillets β antiparallèles. L‟un des feuillets possède une topologie plane reflétant celle de la

cellulose cristalline. Les chaînes latérales de trois résidus aromatiques se superposent aux

anneaux de glucose de la chaîne cellulosique. De plus, plusieurs acides aminés polaires situés

sur la surface liante sont susceptibles de créer des liaisons polaires avec les groupes

hydroxyles (Charnock et al., 2002).

Dix résidus de CtCBM3a participent à la liaison avec la cellulose dont cinq résidus à la

surface (Trp118, Arg112, Asp56, His57, Tyr67) et les cinq autres résidus comme résidus

d‟ancrage (Asn16, Gln110, Ser12, Asn10, Ser113) (Tormo et al., 1996). Les résidus d‟ancrage

pourraient établir des liaisons hydrogènes avec des chaînes de cellulose. Il a notamment été

montré que les résidus His57 et Tyr67 peuvent former des liaisons hydrogènes fortes avec les

unités de glucose de la cellulose et stabiliser la conformation de liaison.

Le CBM3a a largement été étudié. La recherche de la spécificité de ce CBM

(Hernandez-Gomez et al., 2015; Poole et al., 1992), de sa structure (Lamed et al., 1994; Yaniv

et al., 2013), une étude structure-fonction (Lehtio et al., 2003) et la dégradation de substrats

lors de l‟association entre une cellulase et ce CBM (Carrard et al., 2000) ont été réalisées.

Peu d‟informations existent sur l‟affinité du CBM3a avec des polymères (Tableau 12).

L‟étude de Poole met en évidence la liaison entre le CBM3a et de la cellulose (Avicel ou

PASC) mais ceci n‟est pas quantifié (Poole et al., 1992). En effet, l‟équipe utilise la méthode

d‟association qualitative entre une protéine et un ligand (nommée « pull down assay » en

anglais). Le principe est de mettre la protéine et le ligand en contact durant environ une heure

puis de laver le ligand. La protéine peut être éluée avec du mercaptoéthanol par exemple.

Après dépot des fractions sur un gel SDS-PAGE il est possible de déterminer si la protéine

s‟est liée au ligand. Seule l‟étude de Hernandez-Gomez a déterminé l‟affinité entre le CBM3a

et un polymère. Cependant, il ne s‟agit pas du ligand prinicpal du CBM3a qui est la cellulose

cristalline. A ma connaissance, aucune donnée qualitative n‟a été publiée sur l‟affinité entre le

- 76 -

CBM3a et la cellulose même si d‟après l‟étude d‟Hernandez-Gomez, l‟affinité du CBM3a

pour la cellulose cristalline est entre 50 et 100 fois plus importante que celle pour les

xyloglucanes (Hernandez-Gomez et al., 2015). Ceci correspondrait à une constante d‟affinité

du CBM3a pour la cellulose cristalline entre 4,75 10

⁵

M

^-1

à 9,5 10

⁵

M

^-1

. En général, les

constantes d‟association entre un CBM de type A (dont fait partie le CBM3a) et la cellulose

cristalline sont de l‟ordre de 10

6

M

^-1

(Gilkes et al., 1992).

Tableau 12 : Données de la littérature sur la caractérisation de l‟affinité du CBM3a d‟intérêt.

AGE : gel d‟affinité ; M : microcalorimétrie.

CBM3a de CipA du cellulosome de C. thermocellum

(Poole et al., 1992) (Hernandez-Gomez et al., 2015)

méthode AGE M

Avicel affinité X

PASC affinité X

xyloglucanes X K

a

= 9,5.10

³

M

^-1

Afin de compléter ces données, les affinités entre plusieurs CBMs de la famille 3 avec

la cellulose sous différentes formes ont été publiées (Tableau 13). D‟après le travail de

Tomme et ses confrères (Tomme et al., 1998) le K

a

du CBM3 pour la BMCC est compris

entre 1,7 10

⁶

M

^-1

(pour le CBM de CbpA de C. cellulovorans) et 2,9 10

⁷

M

^-1

(pour le CBM de

la protéine charpente CipC de C. thermocellum). L‟équipe de McLean a également travaillé

sur un CBM3 dont le K

a

pour la BMCC était de 10

⁶

M

^-1

(McLean et al., 2002). La méthode

utilisée par Tomme et ses collègues (Tomme et al., 1998) correspond à la méthode solid state

depletion (Chapitre 2. 5. I). L‟équipe de McLean a déterminé la constante d‟affinité à partir

d‟une méthode légèrement différente, la solid state depletion basée sur la fluorescence

(McLean et al., 2002).

Tableau 13 : Données de la littérature sur l‟affinité entre un CBM3 et différentes préparations de

cellulose.

BMCC : bacterial microcrystalline cellulose ; PASC : phosphoric acid-swollen cellulose ; SSD: solid state

depletion ; SSDF : solid state depletion basé sur la fluorescence ; CbpA : protéine charpente du cellulosome de

Clostridium cellulovorans.

CBM

testé

CBM3 de CipC du

cellulosomede C. thermocellum ^{CBM3 de CbpA du cellulosome de Clostridium cellulovorans}

K

a

(M

^-1

) (Tomme et al., 1998) (Tomme et al., 1998) (Goldstein et al., 1993) (McLean et al., 2002)

méthode SSD SSD SSD SSDF

BMCC 2,9.10

⁷

1,7.10

⁶

X 1.10

⁶

PASC 6,7.10

⁷

X X 1,1.10

⁶

- 77 -

Les valeurs observées pour la PASC sont comprises entre 10

⁶

M

^-1

(McLean et al.,

2002) et 6,7 10

⁷

M

^-1

(Tomme et al., 1998), l‟ordre de grandeur est le même que pour la

BMCC. La liaison entre l‟Avicel et un CBM de la famille 3 est également caractérisée par une

constante d‟affinité de l‟ordre de 10

6

M

^-1

(Goldstein et al., 1993; Tomme et al., 1998).

La diversité et la complexité de la lignocellulose au niveau chimique et structurel

contribuent de manière significative à sa récalcitrance aux attaques chimiques ou biologiques

(Fontes and Gilbert, 2010; Himmel et al., 2007). Bien que les polysaccharides soient une

source de carbone pour de nombreux microorganismes, les plantes ont évolué pour résister

aux attaques microbiennes et enzymatiques, en termes de tissus, compartimentation et

stratégie de reproduction (Sarkar et al., 2009). En conséquence, de nombreuses enzymes sont

nécessaires pour déconstruire la biomasse végétale. Les microorganismes suivent une des

deux stratégies pour dégrader la biomasse lignocellulosique, en produisant des enzymes sous

forme libre ou sous forme liée, dans un cellulosome.

Dans le document Création d'enzymes multimodulaires à façon dédiées à la dégradation de substrats complexes (Page 74-80)