Activité des enzymes sur substrat soluble

Dans un premier temps, les activités des différentes enzymes (NpXyn11A,

InNpXyn11A, InNpXyn11A-Jo et InNpXyn11A-JoCBM3a) ont été mesurées et comparées en

utilisant des substrats solubles. L‟objectif est d‟étudier l‟impact du CBM3a sur l‟activité de la

xylanase, les autres enzymes, (InNpXyn11A et InNpXyn11A-Jo) sont des contrôles. Le

premier substrat est du pNP-X

₃

, un substrat chromogénique dont l‟utilisation a déjà été décrite

pour la NpXyn11A (Vardakou et al., 2008). La libération du groupement chromogénique

4-nitrophényle au cours de l‟hydrolyse est suivie par spectrophotométrie à 401 nm (Chapitre 2.

6. I. a). Les valeurs des activités spécifiques pour les différentes enzymes sont données dans

le Tableau 46 : à partir de l‟activité spécifique déterminée pour chaque lot protéique, une

moyenne a été calculée pour chaque enzyme.

- 188 -

Tableau 46 : Activité spécifique des enzymes sur du pNP-X

3

.

AS : activité spécifique ; UI.mg

^-1

: libération d‟une µmole de pNP par minute.

enzyme AS sur pNP-X

3

(UI.mg

^-1

) nombre de lots protéiques

NpXyn11A 5,04 ± 2,20 4

InNpXyn11A 3,09 ± 0,80 8

InNpXyn11A-JoCBM3a 1,94 ± 0,34 4

InNpXyn11A-Jo 1,69 1

L‟activité spécifique de l‟enzyme sauvage est de 5,04 ± 2,20 UI.mg

-1

sur le pNP-X

3

et

celle d‟InNpXyn11A est égale à 3,09 ± 0,80 UI.mg

^-1

. Les activités spécifiques sont similaires

en prenant en compte les écarts types. Par conséquent, la présence du module In n‟altère pas

l‟activité du domaine catalytique sur ce substrat. Ce résultat concorde bien avec les résultats

décrits dans le chapitre précédent (Chapitre 3. 2. II. b). Par ailleurs, l‟activité spécifique de

l‟enzyme multimodulaire InNpXyn11A-Jo est de 1,69 UI.mg

^-1

. Même si l‟activité

d‟InNpXyn11A-Jo n‟a pas été mesurée en réplicat, il semblerait que cette activité soit

significativement plus faible que celle d‟InNpXyn11A. Dans ce cas, il est possible que la

formation du complexe JoIn du côté N-terminal du module catalytique entraine une proximité

trop proche entre le domaine catalytique et JoIn, gênant ainsi l‟accessibilité du substrat. Il est

également possible que JoIn entraine un encombrement stérique modifiant le mouvement du

pouce du domaine catalytique de la xylanase et diminuant d‟autant son activité spécifique

(Chapitre 1. 5. II). De plus, l‟activité spécifique d‟InNpXyn11A-JoCBM3a est égale à 1,94 ±

0,34 UI.mg

^-1

, cette valeur est similaire à celle d‟InNpXyn11A-Jo. Cette activité spécifique est

également proche de celle de l‟enzyme InNpXyn11A. La présence du CBM3a ne modifie

donc pas l‟activité spécifique.

Des variations lors de la détermination de la concentration en enzyme, de la préparation du

milieu réactionnel (lot de tampon et de substrat différents) ou de la durée entre la purification

de la protéine et la détermination de son activité peuvent expliquer pour chaque enzyme les

écarts-types observés à partir de lots protéiques différents (Tableau 46).

Le second substrat soluble utilisé est le xylane de hêtre. L‟hydrolyse de ce polymère

de xylose a été suivie par HPAEC-PAD (Chapitre 2. 6. III). Cette approche nous a permis de

déterminer au cours du temps la variation des concentrations en xylooligosaccharides, du

xylose au xylohexaose (Figure 54).

Pour toutes les conditions enzymatiques testées, la concentration en xylose et xylobiose

augmente au cours de la réaction, entre 0,75 et 4 mM et entre 3 et 7,5 mM respectivement.

- 189 -

A) B)

- 190 -

E) F)

Figure 54 : Variation des concentrations en xylooligosaccharides au cours de l‟hydrolyse du xylane de hêtre par différentes formes de NpXyn11A.

Quantification de A) xylose ; B) xylobiose ; C) xylotriose ; D) xylotétraose ; E) xylopentaose ; F) xylohexaose. En carré rouge : NpXyn11A ; en losange bleu foncé : InNpXyn11A ; en carré

orange : InNpXyn11A + CBM3a ; en losange bleu clair : InNpXyn11A-JoCBM3a ; en triangle vert clair : InNpXyn11A-Jo. Expériences réalisées en triplicat.

- 191 -

Au contraire, celle en xylotriose diminue entre 3,5 et 0,25 mM. Les concentrations en

xylotétraose, xylopentaose et xylohexaose sont inférieures à 1 mM. Il est également possible

que les enzymes aient produit des xylooligosaccharides présentant un degré de polymérisation

supérieur à 6 et/ ou des substitutions, mais ces xylooligosaccharides ne sont pas quantifiés

dans cette analyse. Dans un premier temps, les enzymes ont dégradé le xylane en produisant

divers xylooligosaccharides plus ou moins substitués. L‟absence de xylopentaose et de

xylohexaose dès 20 minutes de réaction signifie que la réaction est très avancée (Figure 54E

et Figure 54F). En effet, dans un deuxième temps les enzymes ont clivé le xylotétraose, le

xylopentaose et le xylohexaose en libérant majoritairement du xylotriose. La concentration en

xylotriose diminue entre 20 minutes et 4 heures (Figure 54C) ce qui correspond à la troisième

phase, où les enzymes hydrolysent le xylotriose en produisant du xylose et du xylobiose

(Figure 54A et Figure 54B) car les autres substrats potentiels (xylooligosaccharides de DP

supérieur à 3) sont en faibles quantités ou absents du milieu réactionnel. Ceci est en accord

avec la caractérisation biochimique de la xylanase (Vardakou et al., 2008).

L‟enzyme InNpXyn11A produit 5 mM de xylobiose et 0,5 mM de xylotriose après 3

heures de réaction (Figure 54B et Figure 54C). Ces valeurs sont inférieures à celles de

l‟enzyme sauvage, pour laquelle 6,8 mM de xylobiose et 1 mM de xylotriose ont été

quantifiées. De plus, les profils de xylose sont similaires pour les deux enzymes (Figure 54A).

La présence d‟In semble limiter l‟activité enzymatique sur ce subtrat qui est plus long que le

pNP-X

₃

et pour lequel la diffusion du substrat jusqu‟au site catalytique est moins rapide.

Cenpendant, il faudrait confirmer ou infirmer cette tendance par de nouvelles expériences,

avec des écarts-types plus petits.

En parallèle, l‟enzyme multimodulaire InNpXyn11A-Jo produit 2 mM de xylose et 4,5 mM de

xylobiose après 2 heures de réaction soit des valeurs inférieures à celles de NpXyn11A, égales

à 3 mM et 6 mM respectivement (Figure 54A et Figure 54B). En parallèle, en présence

d‟InNpXyn11A-Jo 1,5 mM de xylotriose est quantifié après 3 heures de réaction, une valeur

supérieure à celle de l‟enzyme sauvage, égale à 1 mM (Figure 54C). L‟enzyme InNp

Xyn11A-Jo produit donc moins de xylose et xylobiose que NpXyn11A et en parallèle elle accumule

plus de xylotriose et de xylotétraose. InNpXyn11A-Jo est donc moins active. Ainsi, pour un

temps donné de l‟expérience, la réaction est moins avancée. Ceci est en accord avec les

expériences réalisées avec du pNP-X

3

car son activité spécifique est plus faible que celle de

- 192 -

l‟enzyme sauvage (Tableau 46). La présence de Jo influencerait donc la capacité de l‟enzyme

à hydrolyser des xylooligosaccharides.

La même tendance est observée pour InNpXyn11A-JoCBM3a qui produit après 2 heures de

réaction 2 mM de xylose et 4 mM de xylobiose (Figure 54A et Figure 54B). L‟activité de

cette enzyme est également inférieure à celle de NpXyn11A. La concentration en xylotriose

est plus faible dans le cas de l‟enzyme multimodulaire, avec par exemple 0,75 mM après 3

heures de réaction contre 1 mM pour l‟enzyme sauvage. La présence du CBM3a ne favorise

pas la dégradation du xylane de hêtre ce qui était attendu car le ligand du CBM, la cellulose,

n‟est pas présent dans ce substrat.

En conclusion, InNpXyn11A-JoCBM3a est légèrement moins active que NpXyn11A sur les

deux substrats solubles.

Dans le document Création d'enzymes multimodulaires à façon dédiées à la dégradation de substrats complexes (Page 190-195)