Sph` ere uniforme centr´ ee sur le faisceau

On s’int´eresse finalement au cas d’une sph`ere homog`ene de susceptibilit´e non lin´eaire χ(3) _non nulle plong´ee dans un milieu de mˆeme indice lin´eaire mais pour lequel χ(3) _{= 0. Dans un premier} temps, on consid`ere le cas d’une sph`ere de taille croissante centr´ee sur le point de focalisation du faisceau. Qualitativement, on peut d´ecrire la d´ependance attendue du signal avec le diam`etre d de la bille : pour d << b, on peut consid´erer que l’accord de phase est r´ealis´e dans toute la bille et le signal doit alors croˆıtre approximativement avec le carr´e du nombre de diffuseurs, soit avec la puissance sixi`eme du diam`etre. Par contre quand le d´ephasage entre les ondes ´emises en diff´erents points de la bille n’est plus n´egligeable, le signal va croˆıtre moins rapidement avec d, puis d´ecroˆıtre. Enfin, dans la limite o`u d >> b, les bords de la bille sont tr`es loin du point de focalisation : le milieu apparaˆıt comme localement homog`ene et le signal diffus´e doit tendre vers 0.

Ce probl`eme a ´et´e ´etudi´e dans la r´ef´erence [88] dans le cas d’un faisceau tr`es fortement focalis´e (NA=1.4) et en n´egligeant la dispersion d’indice dans le milieu. Pour valider notre mod´elisation (et notamment les approximations utilis´ees pour la forme du faisceau), nous allons donc tout d’abord comparer nos r´esultats `a ceux de cette r´ef´erence en utilisant les mˆemes param`etres (fo-

calisation, indice). Afin de limiter le temps de calcul, nous avons utilis´e l’approximation paraxiale pour d´ecrire la forme du faisceau excitateur. L’allure du faisceau excitateur obtenu ne d´ecrit pas parfaitement la forme r´eelle du faisceau (figure 2.25-a) mais permet d’obtenir des r´esultats com- parables `a ceux de Cheng et al. ( 2.25-b).

(b)

0 1 0 -2 -4 2 4 -90 90

z/λ

₁ In tensité φ− k1 z (°)

(a)

Fig. 2.25 – Comparaison des r´esultats obtenusavec le cas d’un calcul exact. (a), intensit´e et phase du faisceau excitateur dans le cas d’un calcul exact (traits pleins noirs), d’un faisceau gaussien (b = 0.28mm) de mˆeme largeur `a mi-hauteur (traits en pointill´es fins, gris clairs) et du faisceau gaussien (b = 0.52mm) consid´er´e dans la r´ef´erence [88] dans l’approximation paraxiale (pointill´es ´epais, gris fonc´es). Les courbes en traits pleins noirs sont identiques `a celles de la r´ef´erence [88]. (b), r´esultats de notre mod´elisation pour les deux faisceaux gaussiens, b = 0.28mm (trait plein gris) et b = 0.52mm (trait pointill´e gris), compar´es aux r´esultats de Cheng et al. pour un cal- cul exact (trait plein noir) et l’approximation paraxiale avec b = 0.52mm (trait pointill´e noir).

Dans notre mod´elisation comme dans la r´ef´erence [88], on retrouve l’allure pr´edite qualitati- vement : les petites billes apparaissent pleines tandis que les billes plus grosses vont apparaˆıtre creuses sur une image THG, d`es que les bords sont suffisamment ´eloign´es pour ˆetre dissoci´es.

On note cependant clairement que la courbe que nous avons obtenue pr´esente des variations par rapport `a celle issue d’un calcul exact, notamment en termes de position du maximum (lequel se situe autour de 0.8λ au lieu de 0.7λ) ; cependant, ces ´ecarts restent faibles si l’on consid`ere que la comparaison a ´et´e men´ee dans le cas le plus d´efavorable (tr`es forte focalisation avec un faisceau diaphragm´e en entr´ee de l’objectif). Le d´esaccord est notablement inf´erieur `a celui annonc´e par Cheng et al. mais il faut noter que dans le cas d’un faisceau gaussien, les auteurs tirent cette conclusion d’un calcul avec un faisceau beaucoup moins focalis´e (b ≈ 0.52mm contre b ≈ 0.28 mm pour d´ecrire la forme exacte du faisceau, voir figure 2.25-a).

Dans les exp´eriences pr´esent´ees par la suite, l’ouverture num´erique utilis´ee est toujours inf´erieure ou ´egale `a 0.9. On peut donc raisonnablement admettre que les erreurs syst´ematiques

du calcul avec l’approximation paraxiale sont n´egligeables et nous avons en cons´equence conserv´e cette approximation dans toutes les simulations ult´erieures.

Pour v´erifier exp´erimentalement ces r´esultats th´eoriques, on a utilis´e des billes de polystyr`ene de tailles diff´erentes dispers´ees dans un gel d’agarose. Comme on cherche `a comparer le niveau de signal obtenu pour diff´erents objets, la mesure est tr`es sensible aux fluctuations du laser, `a la position de l’objectif de collection, aux propri´et´es de diffusion de l’´echantillon dont on fait l’image, etc... Si l’on utilise des ´echantillons diff´erents pour chaque taille de bille ´etudi´ee, on risque donc de cumuler ces diff´erentes sources d’erreur et d’aboutir `a une tr`es grande incertitude sur les rapports des signaux.

-6 -3 0 3 6 0.0 0.5 1.0 z (µm)

d

-6 -3 0 3 6 0.0 0.5 1.0

b

c

e

0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0

_a

Puissance THG (u.a.)

Diamètre des billes (µm) expérience

δ_z= 2.0 µm

simulation

Fig. 2.26 – Signal THG obtenu au centre de billes de diff´erentes tailles.

(a), signal au centre de billes de polystyr`ene de diff´erentes tailles. Les carr´es sont les points exp´erimentaux obtenus `a partir d’une trentaine de billes de chaque taille. Les barres d’erreur ont ´et´e estim´ees `a partir de l’erreur standard sur les rapports de puissance mesur´es. La ligne pleine est un guide visuel. La ligne en pointill´e est la simulation num´erique correspondante. (b), profil THG axial et (c) lat´eral d’une bille de 0.6mm. la bille apparaˆıt pleine. (d), profil axial et (e) lat´eral d’une bille de 3.0mm. La bille apparaˆıt creuse. Barres d’´echelle, 2mm.

Pour limiter ces erreurs, on a choisi d’utiliser des ´echantillons contenant chacun deux types de billes de tailles diff´erentes. Ainsi, en faisant le rapport de la puissance THG obtenue pour chacun des deux types, on s’affranchit de ces erreurs et l’incertitude sur le rapport est nettement diminu´ee. Pour obtenir la courbe de d´ependance en taille, on a combin´e chaque type de billes avec les deux tailles pr´ec´edentes et les deux suivantes. En r´eunissant les diff´erents rapports de puissance THG pour chaque combinaison, on obtient le graphe pr´esent´e sur la figure 2.26 : la courbe est effectivement similaire `a celle d´ecrite th´eoriquement. Les barres d’erreur donn´ees sur la figure sont calcul´ees `a partir de la largeur `a mi-hauteur de la distribution de rapports divis´ee par la racine carr´ee du nombre de billes prises en compte.

A cause de la grande diff´erence de signal selon la taille de la bille, il est difficile d’observer des billes de tailles tr`es diff´erentes. Avec les param`etres de la figure 2.27 (objectif 60x d’ouverture

num´erique 0.9, r´esolution axiale δz = 2mm), on a par exemple un facteur 20 entre la puissance rayonn´ee par une bille de 1mm et par une bille de 300 nm. Il sera donc tr`es difficile d’observer cette derni`ere sans atteindre la saturation au niveau des objets plus gros.

Tout se passe comme si faire l’image d’un objet en THG revenait `a appliquer un filtre passe- bande en fr´equences spatiales sur l’image pour en supprimer les d´etails6<sub>: pour des billes nettement</sub> plus petites que le volume focal, le champ croˆıt avec le nombre de mol´ecules dans le volume focal, donc le cube du diam`etre. La puissance varie donc avec la puissance sixi`eme du diam`etre (voir figure 2.27) : la coh´erence r´eduit la sensibilit´e aux petits objets comparativement au cas d’un processus incoh´erent comme l’´emission de fluorescence. En effet pour un processus incoh´erent, le signal ´emis varie dans ce cas proportionnellement au nombre de mol´ecules fluorescentes dans le volume focal, donc comme le cube du diam`etre de la sph`ere (pour une bille plus petite que le volume focal). 1 0,01 0,1 1 Pu issance T H G (u.a.) Diamètre de la bille (µm) δ_z = 2.0 µm ajustement, pente 6 limite à -10dB

Fig. 2.27 – Signal THG obtenu au centre de billes de diff´erentes tailles.

En ´echelle logarithmique, on retrouve la d´ependance du signal en puissance sixi`eme du rayon. Pour les billes se rapprochant de la taille du volume focal, le d´ephasage du champ provenant des diff´erents points de la bille intervient et le signal croˆıt plus lentement, puis d´ecroˆıt.

Il faut noter cependant que ce r´esultat a ´et´e obtenu dans le cas d’une bille di´electrique (poly- styr`ene) et que la d´ependance obtenue est diff´erente dans le cas d’une bille m´etallique : Lippitz et al. [75] ont ainsi montr´e exp´erimentalement que dans le cas de nanoparticules individuelles d’or de taille tr`es inf´erieure `a celle du volume focal, le signal maximum, obtenu au centre de la particule, variait approximativement avec le carr´e de la surface de la nanoparticule, soit avec la puissance quatri`eme de son diam`etre dans le cas d’une particule sph´erique. En effet, les auteurs attribuent majoritairement l’intensit´e de l’´emission THG `a l’exaltation cr´e´ee par l’excitation

6_{Les objets de grande taille apparaissent donc comme creux (puisque les tr`es basses fr´equences spatiales sont}

r´esonante de plasmons de surface de la particule (voir aussi [109], [110]).

Enfin, r´ecemment, Shcheslavskiy et al. [111] ont cherch´e `a d´etecter des objets de petites tailles grˆace `a l’´emission THG et ont propos´e une variation du signal avec la puissance quatri`eme du rayon. Ils comparent leur r´esultat, obtenu pour des billes di´electriques (verre ou polystyr`ene), `a celui de Lippitz et al., qui concerne des billes m´etalliques. Dans leur exp´erience, les billes diffusent librement en solution et le faisceau excitateur est fixe : le signal THG est obtenu en faisant la moyenne temporelle du signal d´etect´e, pour diff´erentes concentrations, afin d’obtenir le signal d’une bille individuelle. Or, par cette m´ethode, les auteurs mesurent en fait le signal total ´emis par une bille traversant le volume focal, ce qui est ´equivalent `a mesurer le signal total ´emis par une bille fixe lorsque le faisceau excitateur est balay´e dans l’´echantillon. Ainsi, les exp´eriences qu’ils pr´esentent ne sont pas comparables `a celle de la figure 2.27 et de la r´ef´erence [75]. De plus, la th´eorie d´evelopp´ee dans cet article et qui confirme cet exposant 4 est incorrecte puisque les auteurs somment les intensit´es produites en diff´erents points de la bille et non pas les champs. Enfin, les courbes pr´esent´ees dans l’article correspondent non pas `a une puissance 4 mais `a une puissance 4.25-4.5.

On peut par contre comparer leur r´esultat `a celui pr´esent´e dans le paragraphe 2.2.1.2 sur la figure 2.33 qui pr´esente le signal total cr´e´e par une bille fix´ee dans un gel d’agarose lorsque le faisceau excitateur est balay´e dans l’´echantillon. Dans ce cas, nous trouvons ´egalement une variation du signal avec la puissance 4.5 du diam`etre environ.

Dans le document Microscopie par génération de troisième harmonique appliquée à la biologie. (Page 67-71)