ments
4.4.1
Etude de mouvements morphog´en´etiques apr`es photoablation
Une mani`ere non g´en´etique de moduler `a grande distance l’ensemble des mouvements tissu- laires est de perturber l’int´egrit´e m´ecanique de l’embryon afin de modifier le champ de contrainte s’appliquant sur les tissus. Ceci peut, par exemple, ˆetre effectu´e `a l’aide de la photoablation par impulsions femtosecondes d’un ensemble de cellules bien localis´ees, dont la destruction permet
de bloquer certains mouvements morphog´en´etiques. Cette technique a ´et´e caract´eris´ee pour la drosophile par W. Supatto et al. [35, 233] et permet par exemple, en d´etruisant un ensemble de cellules sur le cˆot´e dorsal de l’embryon, de moduler l’invagination du m´esoderme et la formation du sillon c´ephalique (figure 4.30).
(a)
(b)
Fig. 4.30 – Perturbation des mouvements morphog´en´etiques par pho- toablation.
Figure adapt´ee de [168]. (a), principe de la photoablation sur un embryon vu en coupe transversale. Visualis´ee `a l’aide de l’intense fluorescence cr´e´ee par l’ablation, la zone d´etruite par le laser environ 20mm sous la membrane vitelline est tr`es bien localis´ee en 3 dimensions et la membrane elle-mˆeme (visualis´ee par autofluorescence) est intacte (longueur d’onde d’imagerie, 830 nm). (b), mod`ele d’interpr´etation de la perturbation des mouvements morphog´en´etiques induits par une ablation laser dans la r´egion de l’am- nios´erosa (figure 4.6).
On peut ensuite caract´eriser la perturbation obtenue en termes de champ de vitesse par microscopie THG. La figure 4.31 donne une illustration du type de perturbation obtenue apr`es photoablation sur le dos de l’embryon : la suppression de l’invagination du m´esoderme et de la formation du sillon c´ephalique entraˆıne une modification compl`ete du champ de vitesse au niveau du pˆole ant´erieur de l’embryon. Au niveau des contraintes m´ecaniques, ceci se traduit par un passage d’un r´egime de compression `a un r´egime de dilatation des cellules situ´ees au pˆole ant´erieur [35].
La combinaison « tout optique » de la photoablation et de la microscopie THG permet ainsi, `
contrôle
photoablaté
(a)
(b)
20µm
3 µm/min
Fig. 4.31 – Caract´erisation des mouvements perturb´es par photoa- blation en microscopie THG.
(a), image THG du pˆole ant´erieur d’un embryon pendant la formation du sillon c´ephalique (stade 6). (b), champ de vitesse correspondant montrant un mouvement des tissus dirig´e vers le pˆole ant´erieur pour un embryon normal et vers le pˆole post´erieur pour un embryon ayant subi une photoablation. Temps d’acquisition, 3.1 s par image. R´esolution temporelle, 30 s. Echantillonnage lat´eral, 0.4mm/pixel.
dans un contexte enti`erement sauvage, ce qui en fait un outil pr´ecieux pour ´etudier le rˆole des contraintes m´ecaniques dans le d´eveloppement embryonnaire et particuli`erement la m´ecano- sensibilit´e de certains g`enes.
4.4.2
D´emonstration dans des organismes mutants
Comme nous l’avons ´evoqu´e pr´ec´edemment, la THG est ´egalement un outil puissant pour la caract´erisation des mouvements morphog´en´etiques pour des embryons mutants. De nombreux mutants complexes ne sont en effet pas caract´eris´es m´ecaniquement en l’absence de souche transg´enique exprimant une prot´eine fluorescente. Comme l’illustre la figure 4.32 sur l’exemple des mutations dorsal et concertina, la microscopie THG permet d’obtenir avec une pr´eparation minimale de l’embryon une description des mouvements dans un plan d’int´erˆet (sagittal ou pa- rasagittal dans les exemples pr´esent´es sur la figure 4.32).
A titre de comparaison, la visualisation des mouvements `a l’aide de la microscopie en lumi`ere transmise ne permet pas une description rigoureuse des mouvements morphog´en´etiques. La fi- gure 4.33 pr´esente le r´esultat d’une analyse v´elocim´etrique de l’invagination du sillon ventral dans le cas d’un embryon sauvage et dans le cas d’un embryon dorsal (qui ne poss`ede pas de polarit´e dorso-ventrale), dans lequel cette invagination est supprim´ee : si la microscopie THG distingue correctement les deux ph´enotypes, ce n’est pas le cas de la microscopie en lumi`ere trans- mise. En effet, le manque de sectionnement optique ne permet pas de visualiser l’invagination du
50 µm
(a) (b)
Fig. 4.32 – Caract´erisation par imagerie THG d’embryons mutants. (a), comparaison sur une coupe parasagittale d’un embryon normal (en haut) et d’un embryon mutant pour concertina (en bas), qui pr´esente des sillons anormaux apr`es la gastrulation. (b), comparaison sur une coupe sagittale d’un embryon normal (en haut) et d’un embryon pr´esentant la mutation dorsal (en bas), qui ne poss`ede pas de polarit´e dorso-ventrale. 0 10 20 30 -1 0 1 2 3 4 Sauvage, THG Dorsal, THG Sauvage, TL V ite ss e mo ye nn e ( µm/ mi n)
Temps après le début de la gastrulation (min)
(THG)
Fig. 4.33 – Analyse du mouvement d’invagination du sillon ventral dans le cas d’un embryon dorsal.
Vitesse d’invagination dans la direction apico-basale mesur´ee au cours du temps pour une s´equence acquise en microscopie THG (traits pleins) pour un embryon sauvage (en noir) et un embryon dorsal (en gris), et en microscopie en lumi`ere transmise (traits pointill´es). La mesure a ´et´e effectu´ee dans la fenˆetre indiqu´ee sur l’image THG. Une vitesse positive correspond `a un mouvement dans la direction basale (vers l’int´erieur de l’embryon). Les barres d’erreurs sont d´efinies comme la variance des valeurs obtenues en diff´erents points de la fenˆetre.
m´esoderme chez l’embryon sauvage donc sa perturbation chez le mutant dorsal n’apparaˆıt pas. Cette nouvelle approche de microscopie sans marquage pour la caract´erisation de ph´enotypes mutants devrait trouver une large gamme d’applications en biologie du d´eveloppement et parti- culi`erement pour la drosophile, qui constitue un mod`ele majeur en g´en´etique du d´eveloppement.